佐剂性关节炎大鼠肾功能损伤及对肾脏有机阴离子转运体3表达的影响

目的研究佐剂性关节炎(AA)对大鼠肾脏功能和肾脏有机阴离子转运体3(OAT3)表达的影响。方法在大鼠右侧后足趾皮内注射弗氏完全佐剂建立AA模型。固定时间点收集大鼠血液和尿液,观察肾损伤指标的动态变化。通过肾脏的HE染色切片观察肾损伤情况。免疫组化和Western blot检测肾皮质OAT3蛋白和炎性因子白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。结果与正常组相比,AA大鼠关节炎指数评分、继发性足爪肿胀、关节肿胀数、全身评分均显著增加(P<0.05)。X线检测结果显示,AA模型大鼠足爪骨关节出现软组织水肿以及骨畸形的特征。生化指标显示,AA大鼠的肾损伤指标出现明显异常。免疫组化与Western blot结果显示,AA大鼠肾皮质OAT3的表达水平显著降低,同时炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平明显升高(P<0.05)。结论AA大鼠的肾功能损伤可能与肾脏OAT3的表达降低及炎性因子表达升高有关。

菊苣对高尿酸血症鹌鹑肾脏有机阴离子转运体OAT3-LIKE的影响

目的从肾脏转运蛋白角度探究中药菊苣降尿酸的药效机制。方法将40只雄性迪法克鹌鹑按体质量随机分为5组,正常组给予普通饲料,其余各组均给予含酵母饲料(15 g·kg-1·d-1)建立高尿酸血症模型,同时给药组分别给予菊苣5,7.5 g·kg-1·d-1,苯溴马隆20 mg·kg-1·d-1,实验第35天处死。检测鹌鹑血清尿酸(Uric Acid,UA)、尿素氮(Urea Nitrogen,BUN)水平,并用Real-time RT-PCR(Real-time Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction)方法检测其肾脏有机阴离子转运体OAT3-LIKE(Organic Anion Transporter3-LIKE)的mRNA表达水平,同时测定肝脏尿酸代谢相关酶活性。结果与正常组比较,实验第21天、28天、35天模型组鹌鹑血尿酸升高,第35天肾脏OAT3-LIKE m RNA表达水平下降。与模型组比较,实验第35天,菊苣可以降低鹌鹑血尿酸水平,上调其肾脏OAT3-LIKE mRNA表达水平并降低肝脏腺苷脱氨酶(ADA)活性。结论高嘌呤食饵可以成功诱导鹌鹑高尿酸血症;菊苣具有抑制高尿酸血症鹌鹑尿酸生成和促进尿酸排泄的双重作用;菊苣药效机制可能与降低ADA活性及上调OAT3-LIKE表达水平相关。

有机阴离子转运蛋白3在人血管平滑肌细胞的表达

目的检测有机阴离子转运蛋白3(OAT3)及其mRNA在人血管平滑肌细胞的表达,并观察尿酸刺激对其表达的影响。方法分离培养人脐动脉血管平滑肌细胞,随机分为正常对照组及尿酸处理组,提取细胞总RNA,RT-PCR方法扩增特异性OAT3 cDNA片段,制备探针,用Northern blot方法检测各组OAT3 mRNA的表达。提取细胞膜蛋白,用Westernblot方法检测各组OAT3的蛋白表达。结果在正常对照组人血管平滑肌细胞可检测到OAT3mRNA和蛋白的表达。与对照组相比,尿酸处理组血管平滑肌细胞OAT3的表达在mRNA及蛋白水平均显著上调(P<0.05,n=3)。结论人血管平滑肌细胞表达OAT3,尿酸处理可以使其表达上调。提示OAT3可能部分介导血管平滑肌细胞对尿酸的摄取过程。

抗人有机阴离子转运蛋白3抗体制备及其在肾脏定位的研究

目的采用新的基因免疫方法制备小鼠抗人有机阴离子转运蛋白3(anti-humanorganicaniontransporter3,hOAT3)多克隆抗体,并用该抗体对hOAT3在人肾小管上皮细胞的表达进行定位研究。方法应用Accelrys软件分析hOAT3抗原表位,选择其细胞内表位,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法从人肾组织RNA中扩增其261bp的cDNA序列,克隆到pBQAP-TT构建基因免疫载体,与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-FlT3L同时免疫小鼠,5周后获得血清抗体,人肾组织Westernblot和免疫组化鉴定抗体的特异性和定位表达。结果成功构建基因免疫载体pBQAP-TT-hOAT3,序列分析鉴定正确,ELISA方法测得抗体滴度高达1∶3000,该抗体识别人肾皮质膜蛋白62×103的hOAT3,人肾组织免疫组化提示该抗体识别定位在肾小管上皮细胞基底膜。结论成功用基因免疫方法制备高效特异性抗hOAT3多克隆抗体,为今后的生理病理研究奠定基础。

稀土离子对带3蛋白阴离子转运活性及血影膜流动性的影响

测定了Ｌａ２＋、Ｇｄ３＋、Ｔｂ３＋及Ｙｂ３＋四种稀土离子对带３蛋白阴离子转运活性及对血影膜脂流动性的影响。结果如下：（１）稀土离子可强烈抑制带３蛋白的阴离子转运活性，抑制程度随稀土离子浓度增加而增加，最高达到６３．７％。（２）不同的稀土离子对带３蛋白的抑制程度不同，抑制程度从大到小的顺序为Ｙｂ＞Ｔｂ＞Ｇｄ＞Ｌａ。（３）稀土离子可显著降低血影膜流动性，并且在脂双层的全部厚度内都降低，降低的程度随稀土浓度的增大而增大。（４）不同的稀土离子对血影膜流动性的影响不同，作用从大到小的顺序与它们对带３蛋白活性抑制程度大小的顺序一致。（５）稀土离子对血影膜流动性的影响特征与稀土离子抑制带３蛋白活性的特征完全相符，带３蛋白中承担阴离子转运功能的部分是贯穿性膜蛋白，并且在阴离子转运过程中要发生显著的构象变化，因此稀土离子可能是通过作用于膜脂再影响带３蛋白活性的。

带3蛋白6种跨膜截断体阴离子转运功能的研究

目的 探寻带 3蛋白膜段域不同跨膜片段在带 3蛋白离子转运过程中的作用。方法 构建编码带 3蛋白膜段域片段的重组质粒 ,将其转入酵母细胞诱导表达 ,并以蛋白免疫印记及荧光探针的方法检测目的蛋白。结果 拥有前 1 0个跨膜α螺旋的带 3蛋白片段TM1 1 0具有氯离子转运活性 ,而TM1 8,TM1 9则完全失去功能。此外 ,删除C末端后 1 6个氨基酸的带 3蛋白膜段域片段功能与拥有全长膜段域的带 3蛋白相仿。结论 TM1 0在带

G6PD缺乏红细胞膜Band3蛋白阴离子转运功能的改变

目的 :探讨葡萄糖 - 6 -磷酸脱氢酶 (G6PD)缺乏红细胞膜Band3蛋白阴离子转运功能的改变及影响因素 .方法 :利用测定细胞在等渗氯化铵溶液中的溶血t1/2 来揭示正常与异常红细胞阴离子转运功能的改变及巯基还原剂的修复 .结果 :G6PD缺乏红细胞 ,Band3蛋白阴离子转运活性较正常对照明显减弱 ,而DTT或巯基乙醇可恢复其阴离子转运活性 .结论 :氧化通过修饰G6PD缺乏红细胞膜蛋白巯基来降低阴离子转运活性 ,这可能成为红细胞溶血的一个重要机制 。

有机阴离子转运多肽3参与全氟辛烷磺酸诱导支持细胞损伤

目的 ：探讨Oatp3在PFOS诱导的支持细胞毒性中的作用。方法 ：体外分离纯化原代大鼠支持细胞,通过细胞毒性实验,观察PFOS对原代支持细胞生长的影响;利用Oatp3 si RNA构建Oatp3基因敲减模型,观察Oatp3在PFOS诱导的支持细胞毒性中的作用,并采用Western blot法检测PFOS对Oatp3蛋白表达的影响。结果：0-30μmol/L剂量的PFOS对大鼠支持细胞生长无明显影响（P〉0.05）;当PFOS剂量增至40μmol/L时,对支持细胞毒性作用明显（P〈0.01）,PFOS毒作用的IC50值约为45.6μmol/L。40μmol/L的PFOS可明显诱导Oatp3蛋白的表达（P〈0.01）,联合Oatp3 si RNA处理后,其诱导作用明显抑制（P〈0.01）。与转染试剂对照组（Mock）相比,加入40μmol/L的PFOS后,支持细胞存活率明显降低（P〈0.01）,联合Oatp3 si RNA处理后,PFOS诱导的支持细胞毒性明显被抑制（P〈0.05或P〈0.01）。结论：Oatp3很可能参与PFOS诱导支持细胞损伤。

鸡OATP1B3互作蛋白筛选及其相关基因的转录表达分析

【目的】筛选鉴定鸡有机阴离子转运多肽1B3(OATP1B3)的互作蛋白,并探究其对鸡蛋绿壳颜色形成的影响,为提高绿壳蛋鸡群体选育准确性提供参考依据。【方法】以真核表达载体p EGFP-SLCO1B3和空载体pEGFP-C1分别转染绿壳型赤水乌骨母鸡蛋壳腺上皮细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)结合液相色谱与串联质谱联用技术(LC-MS/MS)筛选鸡OATP1B3互作蛋白,经GO功能注释分析、KEGG信号通路富集分析及蛋白相互作用网络分析鉴定出与鸡蛋绿壳性状形成相关的OATP1B3互作蛋白。同时,通过构建SLCO1B3基因沉默及过表达载体分别转染蛋壳腺上皮细胞,检测SLCO1B3基因过表达或沉默时部分OATP1B3互作蛋白基因(FXR1、CTTN、RPL12和RPS17)在蛋壳腺上皮细胞中的表达情况,并根据鸡蛋壳颜色分为白壳、浅绿和深绿3种类型,分析蛋壳颜色△a*值与FXR1、CTTN、RPL12和RPS17基因表达的相关性。【结果】共筛选鉴定出37个与鸡OATP1B3相互作用的蛋白,其中FXR1、CTTN、RPL12和RPS17与鸡蛋的绿壳性状有密切关系。SLCO1B3基因过表达能极显著下调蛋壳腺上皮细胞内FXR1基因的表达(P<0.01,下同),显著上调RPL12基因表达(P<0.05,下同),极显著上调RPS17基因表达;当SLCO1B3基因沉默后,蛋壳腺上皮细胞内FXR1和CTTN基因的表达极显著上调,而RPL12基因的表达显著下调。白壳类型赤水乌骨母鸡下丘脑中的FXR1基因相对表达量极显著高于绿壳类型赤水乌骨母鸡,肝脏中的RPL12和RPS17基因相对表达量极显著或显著高于绿壳类型赤水乌骨母鸡;此外,FXR1基因在下丘脑中的相对表达量与蛋壳颜色△a*值极显著正相关,RPL12基因在蛋壳腺和肝脏中的相对表达量与蛋壳颜色△a*值极显著正相关。【结论】筛选鉴定出的37个鸡OATP1B3互作蛋白主要定位于细胞质和细胞核,具有蛋白结合能力及结构分子活性,主要参与细胞过程、生物调节和能量代谢。在鸡壳腺上皮细胞内SLCO1B3基因与FXR1、CTTN、RPL12和RPS17基因间存在调控关系,其中,FXR1和RPL12基因在鸡蛋绿壳性状的形成过程中发挥着重要作用。

大鼠无肝状态肾脏罗库溴铵相关转运蛋白OATP-3及其基因的表达变化的研究

目的研究无肝状态前后大鼠肾脏罗库溴铵相关转运蛋白阴离子转运多肽3(organanion transportingpoly peptides3,oatp3)及其基因表达的变化,以期初步阐释罗库溴铵无肝期肝外代谢特点形成的原因。方法12只大鼠随机分为2组(6只/组),对照组与阻断肝门60min组,取各组大鼠肾脏组织,采用Westernblot检测各组OATP3蛋白的表达。采用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)检测各组oatp3mRNA的表达。结果大鼠肾脏组织OATP3蛋白表达水平阻断肝门60min组表达水平高于对照组(P<0.01);大鼠肾脏组织oatp3mRNA表达水平阻断肝门60min组明显高于对照组(P<0.05)。结论大鼠肾脏组织oatp3在无肝期比无肝期前增多,oatp3基因表达在无肝期比无肝期前增多,这可能是罗库溴铵无肝期肝外代谢增强的机制。

硫酸吲哚酚通过有机阴离子转运蛋白-3和氧化应激诱导心肌肥大及纤维化的作用

目的探讨硫酸吲哚酚(IS)通过有机阴离子转运蛋白-3(OAT-3)及氧化应激诱导心肌肥大及纤维化的作用。方法对大鼠心肌细胞(H9C2)进行传代培养,并分为四组:Control组、IS组、小干扰RNA(siRNA)阴性对照组(siOAT-3)及siOAT-3+IS组。Control组常规培养,不进行IS刺激;IS组加入含250μmol浓度的IS刺激;siRNA阴性对照组加入20 nmol/L OAT-3 siRNA;siOAT-3+IS组加入20 nmol/L OAT-3 siRNA 48 h后,加入IS刺激24 h。采用RT-PCR方法检测并分析各组细胞中OAT-3、NADPH氧化酶-4(Nox-4)、抗氧化蛋白[核因子E2相关因子2(Nrf-2)、血红素加氧酶1(HO-1)]、心肌肥大指标[心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链基因(β-MHC)]及纤维化指标[转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad同源物3(Smad-3)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)]的mRNA表达水平。H9C2细胞进一步分为Control组、IS组以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)组,NAC组以抗氧化剂NAC预处理后加入250μmol浓度的IS刺激24 h,采用RT-PCR试验方法检测上述指标的mRNA表达水平。结果IS组H9C2细胞中OAT-3的mRNA表达水平显著高于Control组,siOAT-3组及siOAT-3+IS组H9C2细胞中OAT-3的mRNA表达水平显著低于IS组(P<0.001)。相较于Control组,IS组H9C2细胞中Nox-4、ANP、BNP、β-MHC、TGF-β1、Smad-3以及CollagenⅠ的mRNA表达水平明显升高(均P<0.001),Nrf-2、HO-1的mRNA表达水平明显降低(均P<0.001)。相较于IS组,siOAT-3组及siOAT-3+IS组H9C2细胞中Nox-4、ANP、BNP、β-MHC、TGF-β1、Smad-3以及CollagenⅠ的mRNA表达水平明显降低(均P<0.001),Nrf-2、HO-1的mRNA表达水平明显升高(均P<0.001)。以NAC预处理H9C2细胞,能显著抑制IS诱导的Nox-4、ANP、BNP、β-MHC、TGF-β1、Smad-3以及CollagenⅠmRNA的高表达(均P<0.001),显著增高Nrf-2、HO-1 mRNA表达水平(均P<0.01)。结论IS在H9C2细胞中通过OAT-3和氧化应激诱导心肌肥大和纤维化因子高表达。

红细胞阴离子转运蛋白的结构和功能

红细胞阴离子转运蛋白（简称带３）介导的ＨＣＯ３－／Ｃｌ－交换在组织ＣＯ２运输和肺ＣＯ２排出过程中起重要作用，本文概述带３的结构和生理功能，重点讨论带３的阴离子转运功能及其结构基础。

miR-1-3p/206/613对LXRα和OATP1B1蛋白表达的影响及其机制研究

目的:探究miR-1-3p、miR-206和miR-613对肝X受体α(LXRα)和有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)蛋白表达及OATP1B1转运能力的影响及其机制研究。方法:通过生物信息学数据库预测可靶向作用于LXRα和OATP1B1 mRNA 3'-UTR的miRNAs;采用RT-q PCR、Western blot方法检测miR-1-3p/206/613及LXRα和OATP1B1蛋白水平;采用LC-MS/MS方法检测Hep G2细胞中瑞舒伐他汀(RSV)的含量;应用双荧光素酶报告基因法,研究miR-1-3p/206/613影响LXRα和OATP1B1表达的分子机制。结果:预测结果表明miR-1-3p/206/613与LXRα和OATP1B1 mRNA 3'-UTR互补配对,且具有较高的特异性、保守性及结合稳定性。与对照组相比,miR-1-3p/206/613 mimics能明显下调Hep G2细胞中LXRα蛋白表达水平16.5%、16.0%、25.1%,OATP1B1蛋白30.4%、30.5%、44.4%;相反,miR-1-3p/206/613 inhibitors明显上调LXRα蛋白表达水平13.3%、13.3%、16.0%,OATP1B1蛋白25.0%、25.6%、30.4%。当RSV浓度为5、60、125μmol/L时,miR-1-3p/206/613mimics显著减少Hep G2细胞对RSV的摄取至对照组的0.50、0.19、0.30倍,0.49、0.24、0.23倍和0.64、0.48、0.31倍;与之相反,miR-1-3p/206/613inhibitors上调1.26、1.59、2.07倍,1.97、2.44、2.63倍,2.22、2.86、2.93倍。与对照组相比,miR-1-3p/206/613 mimics或miR-1-3p/206/613 inhibitors,p GL/LXRα-WT报告基因荧光素酶活性分别下降38.5%、32.5%、32.8%或升高137.0%、75.8%、55.7%,而p GL/LXRα-Mut报告基因荧光素酶活性未见明显改变;同上,p GL/OATP1B1-WT报告基因荧光素酶活性下降24.3%、28.9%、32.1%或升高33.5%、48.3%、61.6%,而p GL/OATP1B1-Mut报告基因荧光素酶活性也未见明显改变。结论:miR-1-3p/206/613既可通过直接靶向作用于OATP1B1 mRNA 3'-UTR而调控OATP1B1的蛋白表达和转运功能,也可通过靶向作用于LXRαmRNA 3'-UTR而发挥间接调控作用。

9种注射用辅料对肝脏有机阴离子转运多肽OATP1B1和OATP1B3的影响

目的研究9种注射用辅料对HepG2细胞上OATP1B1和OATP1B3转运体的影响。方法采用噻唑蓝法考察9种注射用辅料对HepG2细胞存活率的影响;实时荧光聚合酶链反应法以及蛋白质印迹法测定辅料对HepG2细胞中OATP1B1和OATP1B3 mRNA及蛋白表达量的影响;以匹伐他汀作为探针底物,用LC-MS/MS法检测细胞摄取实验中匹伐他汀的胞内蓄积量。结果Tween80和大豆油能显著性下调HepG2细胞内OATP1B1 mRNA和蛋白表达,甘露醇仅能下调OATP1B1 mRNA的表达量而对蛋白表达无影响;Tween20、Tween80、蔗糖、PEG600和PEG4000能显著下调HepG2细胞内OATP1B3 mRNA和蛋白的表达;PEG600和PEG4000能显著降低HepG2细胞内匹伐他汀的蓄积量。结论PEG600和PEG4000能通过抑制OATP1B3mRNA和蛋白表达而减少匹伐他汀在HepG2细胞上的摄取量。

恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白表达及其对K562细胞生长的影响

背景与目的:带3蛋白介导Cl-/H CO3-的跨膜交换,从而调节细胞内pH值。有学者证实,Cl-/H CO3-交换的异常可引起细胞内pH值明显改变,使细胞发生增殖或凋亡。本研究旨在探讨红细胞膜带3蛋白的表达及其对K562细胞生长的影响。方法:以SPQ为荧光探针测定8例恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白的阴离子转运活性,W estern blot检测带3蛋白表达。转染带3蛋白膜段结构域cDNA至K562细胞,观察带3蛋白膜段结构域表达后对K562细胞阴离子转运活性及细胞增殖的影响。结果:7例恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白的离子转运活性明显增强,5例蛋白质表达增强。同时发现带3蛋白膜段结构域表达于K562细胞膜后,对K562细胞生长有一定促进作用。结论:带3蛋白在部分恶性肿瘤患者红细胞膜表达增强,可作为恶性肿瘤的一种潜在标志物。

放疗对恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白表达和功能的影响

[目的]研究放疗对恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白的表达和功能的影响。[方法]随机抽取8例恶性肿瘤患者并取其治疗前后的红细胞,应用Clˉ荧光探针6-甲基-3-磺丙基-1-喹啉-水化合物(SPQ)检测其治疗前后红细胞膜带3蛋白的阴离子转运活性,并通过Westernblot检定治疗前后带3蛋白表达量的变化。[结果]8例恶性肿瘤患者放疗后红细胞膜带3蛋白的离子转运活性均明显减弱,其中6例患者红细胞膜带3蛋白表达减少。[结论]带3蛋白的表达和功能与肿瘤细胞的增殖和凋亡相关。

非小细胞肺癌红细胞膜带3蛋白功能的观察

目的观察早晚期非小细胞肺癌患者红细胞膜带3蛋白功能变化。方法正常对照组:健康成年人15名;早期组:Ⅰ、Ⅱ期非小细胞肺癌15例;晚期组:Ⅳ期非小细胞肺癌15例。应用Cl-荧光探针6-甲基-3-磺丙基-1-喹啉-水化合物(SPQ)分别检测3组红细胞膜带3蛋白的阴离子转运活性。结果晚期组患者红细胞膜带3蛋白的离子转运活性明显比早期组升高。结论晚期非小细胞肺癌红细胞膜带3蛋白的离子转运活性升高。提示带3蛋白的阴离子转运活性与非小细胞肺癌的发生、发展有关。

红细胞膜带3蛋白酪氨酸磷酸化的研究进展

生理红细胞膜带 3蛋白磷酸酪氨酸因受PTKs及PTPs作用而处于低水平 ,体外某些因素通过作用于PTKs及PTPs来改变酪氨酸的磷酸化状态 ,而酪氨酸磷酸化的增强是细胞膜骨架、形态、代谢乃至带

用改良的基因免疫方法制备小鼠抗人OAT3多克隆抗体

目的用改良的基因免疫的方法制备小鼠抗人有机阴离子转运蛋白3(hOAT3)多克隆抗体。方法提取人肾组织总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增hOAT3基因中免疫原性较强的细胞内亲水序列片段,克隆到T-A克隆载体pCR2.1中构建pCR2.1-hOAT3载体,再从pCR2.1-hOAT3中用特异性内切酶BclI和XmaI切下hOAT3基因片段,亚克隆到载体pBQAP-TT中构建基因免疫载体pBQAP-TT-hOAT3,酶切及序列分析鉴定正确后,用基因枪与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-Fit3L同时免疫小鼠,12周后分离血清,ELISA方法测定抗体滴度,人肾组织Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性和定位表达。结果成功扩增出228bp的hOAT3细胞内亲水序列片段,构建基因免疫载体pBQAP-TT-hOAT3,经酶切及序列分析鉴定正确。Western blot结果显示小鼠抗hOAT3多克隆抗体识别人肾皮质膜蛋白57kD的hOAT3。免疫组化结果显示hOAT3定位表达在人近段肾小管上皮细胞基底侧细胞膜。结论用基因免疫的方法可以成功制备高滴度和特异性抗hOAT3多克隆抗体。