有限稀释法制备RecQ解旋酶单克隆抗体1C1及鉴定

目的:通过有限稀释法制备抗RecQ单克隆抗体(m Ab),鉴定其生物学特性。方法:以纯化鉴定后的重组大肠杆菌RecQ解旋酶免疫Balb/c小鼠,融合免疫小鼠的脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞,有限稀释法筛选杂交瘤细胞,制备m Ab;使用间接ELISA法鉴定单克隆抗体亚型、效价,Western-Blot法测定单克隆抗体特异性;将m Ab与RecQ解旋酶结合后,观察m Ab对RecQ解旋酶活性的阻断作用。结果:获得1株能稳定分泌抗RecQ解旋酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C1,该杂交瘤细胞染色体数目在94～104; 1C1分泌的单克隆抗体类型为Ig G1型,1C1株所得上清液和腹水中抗体效价分别为1×10-3和1×10-5,该单克隆抗体可特异性结合RecQ,并可抑制RecQ解旋酶的结合DNA活性。结论:成功制备1株抗RecQ m Ab,效价高、特异性强。

有限稀释法筛选重组AcNPV病毒

有限稀释法筛选重组ＡｃＮＰＶ病毒钟劲胡美浩１）（北京大学生命科学学院，北京，１００８７１）关键词重组病毒；梯度稀释；筛选；测活中图分类号Ｑ３３２０引言昆虫杆状病毒表达系统是一高效表达外源基因的表达系统。用于基因工程表达外源基因的ＡｃＮＰＶ（ａｕｔｏｇ...

用有限稀释法在昆虫培养细胞中克隆家蚕微粒子(Nosema bombycis)

数株家蚕微粒子(Nosema bombycis)NIS001株的克隆株,是用有限稀释法,在桉大蚕蛾(Antheraea eucalypti)培养细胞系中接种该株孢子的孢原体(sporoplasm)而获得的。稀释感染的桉大蚕蛾培养细胞,并转移到96孔的细胞培养板小孔内,以分离出单个的感染细胞。随机选取一定数目的含单个细胞小孔,这是因为此时还不可能用相差显微镜检查孔内分离的单个细胞是否感染。在这些小孔内加入另一些未被感染的家蚕(Bombyx mori)S.P.C.Bm36或桉大蚕蛾细胞,则孔内可能被单个孢原体寄生的单细胞就会产生家蚕微粒子(Nosema bombycis)NIS001的克隆株来。用此方法分离的数株家蚕微粒子(Nosema bomobycis)NIS001克隆株中,形态差异的孢子可分别观察到。经数次离体培养继代后,孢子的形态特征得以保持下来。胶乳凝集试验结果表明七株克隆的孢子表面抗原具同源性。

有限稀释法筛选轮状病毒LD9株纯化方法的建立及应用

目的:建立有限稀释法克隆纯化轮状病毒的试验方法,筛选出感染性强、遗传特性稳定的轮状病毒基因重配株LD9。方法:梯度稀释LD9毒种,用5个稀释度(10-4～10-8)的病毒感染铺满单层Vero细胞的96孔板细胞,培养6 d,-20℃冻融,培养物传代至24孔板继续培养6 d,显微镜下观察细胞病变(CPE),-20℃冻融后检测。以相同方法重复克隆纯化3次,筛选获得病毒滴度稳定、具有稳定遗传特性的纯化病毒,由T25、T75到2,4,10层细胞工厂逐级放大培养。结果:筛选出适用于疫苗生产用的遗传特性稳定、感染性强的LD9疫苗候选株。结论:建立了适用于轮状病毒克隆纯化的筛选方法。

有限稀释PCR法筛选噬菌体cDNA文库目标克隆

通过已知基因EST序列设计1对特异性引物,经过2轮有限稀释法稀释c DNA文库;利用特异性引物作为探针,从c DNA文库中筛选出目的克隆,最终获得目的基因的全长序列。在此基础上,建立一种以PCR为基础,利用有限稀释法快速、有效筛选噬菌体c DNA文库、分离全长目的基因的技术体系。

有限稀释法分析CMIR-CJ小鼠自身反应性T细胞

口服免疫空弯菌菌苗诱导的慢性粘膜免疫应答(CMIR-CJ)能导致小鼠系统性自身免疫综合征(SAIS)。而SAIS的出现,往往与自身反应性T细胞(auto-T)的活化有关。本文利用CMIR-CJ模型小鼠,用有限稀释分析(LDA)法研究CMIR小鼠体内auto-T,auto-AgT(自身抗原特异性T细胞)及CJ-T(空弯菌特异性T细胞)之间的关系,及其在胸腺、脾脏和淋巴结内的频数分布,探讨CMIR-CJ启动SAIS的机理。结果表明,在CMIR小鼠,auto-T的频数在脾脏较高;auto-AgT的频数在胸腺较高;CJ-T在淋巴结较高。在同一组织内,CJ-T与auto-T、auto-AgT的频数增长呈背离倾向;auto-Ag T(DNA-T与His-T)的增长也不同步,呈优势增殖现象。上述结果提示,CJ-T对auto-T的活化具有启动、辅助作用。持续口服空弯菌菌苗在产生的CMIR,提供了源源不断的CJ-T,使auto-T活化,持续增殖,向不同的auto-AgT分化,参与病理性自身免疫应答。

有限稀释克隆法培养分离人牙周膜干细胞实验研究

目的探讨有限稀释克隆法培养分离人牙周膜干细胞株的实验方法,并对其生物学特性进行初步研究。方法采用有限稀释克隆法对人牙周膜细胞逐步分离筛选,观察分离出的人牙周膜干细胞形态及克隆形成情况,并对其细胞周期、STRO-1、CD146等标志蛋白的表达进行检测,检测其体外诱导成骨的能力。结果通过有限稀释法获得人牙周膜干细胞克隆具有成体干细胞的形态特征;细胞周期分析呈慢周期性;免疫细胞化学染色证实STRO-1、CD146及Vimentin均为阳性染色,矿化诱导证实该细胞可以表达多种骨蛋白标记物。结论采用有限稀释克隆法分离纯化可以获得成体干细胞所具有的细胞周期、表型及骨向分化能力等特点的牙周膜干细胞株。

两种方法纯化胎鼠脑室管膜下区神经干细胞的结果比较

目的利用有限稀释法和连续传代法纯化体外培养的神经干细胞(neural stem cells,NSCs),并对2种方法纯化后的细胞纯度及增生能力进行比较。方法机械分离孕龄14.5d的胎鼠脑室管膜下区细胞,利用有限稀释法和连续传代法纯化NSCs,通过免疫细胞化学法鉴定纯度(Nestin阳性率)及分化细胞的类型。将2种方法纯化后的第3代NSCs以相同的密度接种后连续培养6周,每周进行细胞计数,绘制生长曲线。结果有限稀释法和连续传代法纯化NSCs的Nestin阳性率均高于原代NSCs(31.00%±0.02%),有限稀释法的Nestin阳性率(91.00%±0.03%)高于连续传代法(58.80%±0.02%,P<0.05)。有限稀释法纯化NSCs的生长曲线一直处于增生趋势,而连续传代法的细胞前3周是上升趋势,以后趋于平缓(P<0.05)。结论有限稀释法能有效纯化体外培养的NSCs,并保持细胞良好增生能力及多向分化潜能,为基因治疗视神经损伤疾病提供大量种子细胞。

单细胞显微操作法克隆技术

在生命科学飞速发展的今天，特异单克隆细胞株(系)的选择与培育日益广泛和重要。不用特殊设备、操作简单、快捷、经济、高效、可靠并适合大批量克隆化培养的技术将有利于这一繁重工作的简化和普及。我们在实验中曾试过：有限稀释法、平皿克隆分离法、自制毛细吸管单细胞显微操作法等细胞克隆技术(司徒镇强等，2000．4)。

MDCK单克隆细胞的制备方法研究

为优化有限稀释法制备MDCK单克隆细胞的参数条件,从而提高有限稀释法制备MDCK单克隆细胞株的效率。使用有限稀释法制备MDCK单克隆细胞,通过比较不同类型血清、血清浓度和单孔接种密度对制备MDCK单克隆细胞数的影响,确定有限稀释法制备MDCK单克隆细胞的最佳实验条件。结果显示,添加15%胎牛血清、最佳单孔接种密度为1个·孔^(-1)是制备MDCK单克隆细胞的最佳条件。

有限稀释病人PBMCs共培养法分离培养HIV-1 CRF07_BC生物性克隆病毒

目的通过有限稀释艾滋病病毒(HIV)感染者外周血单个核细胞(PBMCs)与正常供体PBMCs共培养,分离培养HIV-1生物性克隆毒株。方法选择6位新疆HIV-1CRF07_BC感染者,分离病人PBMCs,以不同浓度的病人PBMCs细胞数梯度(推荐浓度分别为5×103、2×104、4×104/孔)与健康供体的1×105PBMCs共培养,每个浓度设置32个复孔,每周检测HIV p24抗原。当某一浓度的复孔中p24阳性率低于33%时,可认为在这些阳性孔中的病毒是起源于同一个感染细胞。同时进行env区V1-V5基因扩增、测序和分析。结果经过有限稀释法共培养后,样本XJZK007在1×104细胞/孔的浓度下,各复孔HIV-1p24阳性率为31.3%;样本CBJB539在4×104细胞/孔的浓度下,得到9.4%分离阳性率;样本CBJB540在2×104细胞/孔的浓度下,得到25%分离阳性率;样本CBJB541在2×104细胞/孔的浓度下,得到12.5%分离阳性率;样本CBJB543在1×104细胞/孔的浓度下,得到21.9%分离阳性率;样本CBJB544在2×104细胞/孔的浓度下,得到25%分离阳性率。同一样本分离的不同生物克隆表现出不同的生物表型。对样本XJZK007分离得到的12株生物克隆的序列分析显示,各序列相互之间存在氨基酸的变异、插入及缺失,从而验证了生物性克隆方法的正确性与可行性。结论有限稀释病人PBMCs共培养方法,以常规分离方法十分之一的细胞数即可分离得到个体内多样性的病毒,即生物克隆病毒。

小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca-F的再克隆技术

[目的 ]探讨小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F的再克隆技术。 [方法 ]采用有限稀释法对已使用多年的小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F进行再克隆 ;6 15小鼠皮下接种 ,检测再克隆瘤株淋巴结转移能力。 [结果 ]共分离出 3个不同的瘤株 ,Hca -F - 2 - 2 4c6 ,Hca -F -3-d4 ,Hca -F - 3-a4 ,流式细胞仪检测证明 3株瘤细胞均为单克隆细胞。动物实验证明三株瘤细胞淋巴结转移率分别为 95 .5 % ,87% ,4 2 .5 %。 [结论 ]有限稀释法操作简单 。

舌癌单细胞培养建系与癌干细胞相关标志的检测

目的以舌癌Tca8113M1细胞系单细胞培养建系为基础,观察Tca8113M1细胞系中舌癌干细胞存在的现象及其相关标志的变化规律。方法选取Tca8113M1细胞系,以有限稀释法进行体外单细胞培养并建立细胞亚系,在证实其成瘤性的基础上,进一步采用流式细胞术检测癌干细胞相关标志CD44、CD184、细胞外可溶性抗原(ESA)的表达情况,着重观察单个细胞培养形成细胞克隆的形态与时间。结果以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单个细胞,在96孔板中进行体外培养,获取12个细胞亚系(获取比例为6.25%),均有高成瘤性。癌干细胞相关标志CD44与ESA均为高水平表达,而CD184表达则在12个细胞系之间有差异。在单个细胞培养中,形成完全克隆、部分克隆与旁克隆3种形态,12个细胞亚系均源于单个细胞形成的完全克隆,均可进行连续传代与扩增,而部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡。结论 Tca8113M1细胞系中可能存在癌干细胞,而单细胞培养可形成完全克隆并建立细胞亚系,是进行舌癌干细胞后续研究重要的细胞培养模式。

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38(SjP38)抗原分子,并以其纯化产物为抗原,制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。方法将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),在1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过镍柱一步法纯化,以纯化的重组SjP38为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,蛋白质印迹法(Westernblotting)分析其特异性。结果筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株,均为IgG1;Westernblotting分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。结论制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。

抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立稳定分泌抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为进一步研究禽流感诊断技术奠定基础。方法以纯化的H5亚型禽流感病毒按常规方法免疫BALBc小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP20细胞在聚乙二醇作用下融合,用选择性培养、有限稀释法克隆和血凝抑制试验进行筛选,对获得阳性克隆株用ELISA方法进行亚型鉴定,并用37株H5、H7、H9亚型AIV测定其特异性、覆盖性。结果最后获得了3株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1E5、4A4、4B1,经长期体外培养和冻存后复苏能稳定地分泌抗体。经鉴定,其亚型均为IgG1、kappa链。腹水HI效价1∶210～1∶216,细胞培养上清HI效价1∶26～1∶28。3株杂交瘤所分泌的单克隆抗体均能与本中心保存的全部20株H5亚型禽流感病毒分离株发生反应,而与15株H9亚型禽流感病毒分离株、2株H7亚型禽流感病毒分离株以及H1H4、H6H15亚型禽流感病毒标准毒株均不反应,与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒等均无交叉反应。结论所获3株单克隆抗体可用于禽流感病毒特异性诊断试剂的研制。

人子宫内膜中存在一群具有克隆增殖能力的细胞

背景:克隆形成能力是干细胞的重要特性,多项研究证明,子宫内膜在起源上具有单克隆性。目的:通过体外培养,检测人子宫内膜细胞克隆形成能力。方法:采用机械和酶消化相结合的方法分离出人子宫内膜细胞,培养腺上皮细胞和基质细胞,观察细胞形态及生长特性并检测波形蛋白和角蛋白的表达,采用流式细胞仪对细胞进行CD133,CD34,CD45,CD90,CD73及CD29表型鉴定;观察细胞克隆生长特点、测量细胞克隆大小和计算克隆形成率。同时取人子宫肌细胞培养作为对照。结果与结论:经过12d的原代培养后,腺上皮细胞和基质细胞均可形成大、小两种克隆。角蛋白表达阳性为腺上皮细胞,波形蛋白表达阳性为基质细胞。流式细胞术检测子宫内膜细胞表达CD90、CD29、CD73等表面标记,不表达CD34、CD45,CD133。腺上皮细胞、基质细胞大克隆和小克隆大小及形成率比较,差异均有显著性意义(P<0.05);人子宫肌细胞用有限稀释法原代培养无细胞克隆生长。说明子宫内膜细胞在体外培养中,腺上皮细胞和基质细胞大克隆增殖能力均高于小克隆。这些细胞可能是子宫内膜干细胞。

系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞克隆与生长异质性

目的分离系统性硬皮病(SSc)和正常皮肤成纤维细胞(FB)克隆,观察其形态和生长特性。方法采用改良的有限稀释法分离SSc和正常皮肤FB克隆,光镜下观察克隆FB细胞形态,应用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态均有异质性,主要分为细小梭形细胞、粗长梭形细胞和大多角形细胞3种。细胞形态呈大多角形的克隆增殖很慢,难以传代和冻存。与细胞形态呈细小梭形的克隆相比,呈粗长梭形的克隆增殖速度较慢,细胞倍增时间较长,G0/G1期细胞比例较高(P<0.05),S+G2/M期细胞比例较低(P<0.05)。SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态和生长特性经数次传代保持稳定。结论SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态和生长特性均有异质性。

抗大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]培养大肠杆菌耐热性肠毒素ST1单克隆抗体的细胞株,建立一种快速、灵敏、特异和便于临床操作的检测耐热性肠毒素ST1的方法。[方法]将制备的ST1包涵体与弗氏完全佐剂充分混匀,免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,然后用间接ELISA法筛选和有限稀释法进行细胞克隆。[结果]获得2株能稳定分泌抗ST1肠毒素单抗杂交瘤细胞株。[结论]将单克隆抗体与酶联免疫吸附实验两者相结合可有效获得所需的杂交瘤细胞株,为下一步临床检测奠定了基础。

重组溶血素蛋白用于单增李斯特菌快速检测的效果

目的制备单增李斯特菌的溶血素重组蛋白,获得溶血素的诊断用抗原和单克隆抗体。方法以PCR法扩增单核细胞增多性李氏杆菌hly基因,构建原核表达载体,获得重组溶血素蛋白,免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。结果运用杂交瘤技术成功得到3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株即2F5、5H1和8F9,并获得免疫球蛋白,测定2F5、5H1和8F9单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG3和IgGM。结论本研究克隆和表达单增李斯特菌的hly基因,研制基于溶血素的诊断用抗原和单克隆抗体,为检验分析单增李斯特菌及制备基因工程疫苗奠定基础。

高低不同分化特性人成骨肉瘤MG-63克隆细胞株的建立

目的:建立分化程度高低不同的骨肉瘤细胞株.方法:用有限稀释法将人成骨肉瘤MG-63细胞系单克隆化,并作如下鉴定:(1)细胞增殖;(2)细胞形态学;(3)软琼脂克隆形成率;(4)染色体分析;(5)细胞周期时相分析;(6)碱性磷酸酶的活性;(7)细胞运动能力;(8)裸鼠成瘤实验.结果:共得到23个克隆,命名为MG-63-1～MG-63-23.其中的5、18号细胞株具有明显差异,18号为大核长梭形细胞,无接触抑制,克隆形成率高,体内成瘤时间短,代表低分化的骨肉瘤细胞株.5号以短梭形为主,核质比例变小,有一定的接触抑制,致瘤能力较低,为高分化的骨肉瘤细胞株.结论:通过对骨肉瘤细胞系MG-63的单克隆化,建立了具有高、低不同分化程度的两个人骨肉瘤细胞株.