木瓜蛋白酶水解对β-酪蛋白膜的形态和黏弹性的影响

目的:评价木瓜蛋白酶水解对牛β-酪蛋白(β-CN)膜表面形态和黏弹性的影响。方法:将β-CN通过自组装固定于芯片表面,采用消散因子石英晶体微天平(quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)测量β-CN膜能量消散因子(ΔD)和频率(ΔF)和黏弹性变化。β-CN膜水解前后的表面形态变化通过原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)表征。结果:伴随着酶浓度提高,残余的β-CN膜的黏弹性增加(P<0.05)。AFM图像显示水解后残余的β-CN膜的厚度和粗糙度均降低。结论:木瓜蛋白酶水解β-酪蛋白β-CN膜的反应具有浓度依赖性特征;水解反应使膜变得较薄而光滑,且更加紧凑和较硬。

木瓜蛋白酶水解对β-酪蛋白膜的润湿性和构象的影响

目的:评价木瓜蛋白酶水解对牛β-酪蛋白(β-CN)膜的润湿性和构象的影响。方法:将β-CN通过自组装固定于芯片表面,采用消散因子石英晶体微天平(quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)测量β-CN膜频率(ΔF)变化。β-CN膜水解前后的润湿性和构象变化分别通过接触角测量仪和掠角红外光谱(GA-FTIR spectra)仪测量。结果:水解后β-CN膜接触角变小,伴随酶的浓度从0.5～12.5mg/L增加,β-CN膜由疏水性向亲水性转变。FTIR测量表明β-CN膜水解后的构象发生了改变。除α-螺旋结构外,β-CN膜含有的二级结构(%)均变小,表明水解反应首先发生与β-CN分子的疏水性C端。疏水性反应和氢键结合是水解反应的主要驱动力。结论:木瓜蛋白酶水解β-酪蛋白β-CN膜导致了润湿性和构象的改变,其生物学意义有待于进一步研究。

木瓜蛋白酶水解β-酪蛋白膜的动力学研究

目的:采用消散因子石英晶体微天平(QCM-D)原位、实时和动态监测木瓜蛋白酶水解β-酪蛋白生物膜的动力学过程,比较不同浓度酶的水解效率。方法:用β-酪蛋白在QCM-D上建立体外蛋白膜模型,采用不同浓度的木瓜蛋白酶水解膜,观察频率和厚度的改变,运用Boltzmann方程对实验数据进行拟合,单因素方差分析和SNK-q检验比较水解参数B、Δh、V50和C。结果:随着酶浓度增大,膜的厚度Δh减薄,ΔF上升增多,水解参数B增大,C减小,V50缩短(P<0.05)。结论:在一定浓度范围内水解蛋白生物膜时,酶的水解效率随浓度增大而提高。

酪蛋白酶解多肽-Fe^(2+)的制备及性质研究

探讨了以酪蛋白为原料,通过木瓜蛋白酶水解并经超滤分离酶解多肽的优化工艺,并对酶解多肽螯合氯化亚铁的性质进行了研究,从而为其在食品中作为铁强化剂的应用打下了基础。

冷冻-真空吸附法在介孔材料中固定木瓜蛋白酶

首次采用冷冻-真空吸附法在介孔材料SBA-15中固定了木瓜蛋白酶.与普通的浸渍方法相比,此法不仅可以制备高组装量的固定化酶,每克载体固定量可达450 mg,同时酶的活性仍然保持,并得到较好的固定化酶性质(如高稳定性),在90℃保温30 m in仍保留70%的活力.

利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶澄清红茶茶汤的研究

为得到优质红茶饮料,利用外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶对红茶茶汤进行沉淀澄清研究。结果表明:两种酶均能显著提高茶汤透光率,起到澄清作用,且效果相当。木瓜蛋白酶最佳反应条件为酶添加量0.3 U/mL、作用温度50℃、作用时间45 min、pH6;α-淀粉酶最佳反应条件为酶添加量30 U/mL、作用温度45℃、作用时间15 min、pH5,但在各自最佳条件下两种酶未表现出协同作用。

壳聚糖-埃洛石纳米管微球的制备及其对木瓜蛋白酶的固定化

运用交联-吸附法制备壳聚糖-埃洛石纳米管(chitosan-halloysites nanotube,CTS-HNTs)复合微球固定木瓜蛋白酶,并通过傅里叶红外光谱、扫描电子显微镜、荧光标记等方法进行表征。2%CTS+1%HNTs制备的微球对木瓜蛋白酶的固定量最高。固定化条件为木瓜蛋白酶质量浓度1 mg/mL、固定化时间10 h。固定化木瓜蛋白酶最适pH 6.8(游离酶pH 7.2)、最适温度60℃(游离酶50℃),保存30 d该酶相对活性为62%(游离酶27%),使用4次后,木瓜蛋白酶的相对活性仍然保留26.26%。CTS-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶耐贮存,操作稳定性强,可以提高酶的利用率,降低酶解的成本,提高生产效率。

酪蛋白酶解产物β-酪啡肽-7的HPLC分析和阿片活性鉴定

利用建立的高效液相色谱(HPLC)定量分析法,在酪蛋白2 h酶解液中检测到134.27μg.mL-1的β-酪啡肽-7(β-CM-7);其酶解消化液经葡聚糖凝胶柱层析收集物3、4组中也检测到β-CM-7,含量分别为44.79和18.90μg.mL-1;而1和2组中未检测到。细胞生物学鉴定结果表明:酪蛋白酶解液、柱层析收集的3、4组均能抑制富含δ-阿片受体的神经杂交瘤细胞腺苷酸环化酶活性,降低细胞内cAM P水平,纳洛酮可逆转这种抑制作用,证明有阿片活性。1、2组和酪蛋白本身无阿片作用。HPLC测定结果与细胞生物学鉴定结果相符,证明所建立的HPLC方法可用于酪啡肽的定量分析。

木瓜凝乳蛋白酶与5-Fu或MTX对人肝癌细胞7402的细胞毒试验

目的 :测定木瓜凝乳蛋白酶及其与 5 氟尿嘧啶 (5 Fu)、氨甲喋呤 (MTX )单独或联合作用对人肝癌细胞740 2的细胞毒性。方法 :采用MTT法 ,不同浓度的酶和药物在不同的培养时间下 ,通过其细胞抑制率和半数抑制率 (IC50 )测定木瓜凝乳蛋白酶及联合药物的细胞毒性。结果 :木瓜凝乳蛋白酶对 740 2细胞的IC50 约为 12 5 μg/mL ,随浓度增加对细胞的抑制率增加。培养 3 6h时酶对细胞的毒性最大。酶与 5 Fu、MTX联合使用比单独使用效果更好。结论 :木瓜凝乳蛋白酶对人肝癌细胞 740 2具有细胞毒作用 ,酶在培养 3 6h时细胞毒作用最大 ;

木瓜蛋白酶-抗痛素技术在红细胞不规则抗体筛查中的应用研究

目的探讨木瓜蛋白酶-抗痛素法在受血者不规则抗体筛检中的临床应用价值。方法用盐水法、木瓜蛋白酶-抗痛素法对2016例患者进行不规则抗体的筛查和鉴定,并对阳性血清用凝聚胺法、经典间接抗人球蛋白试验予以确证。结果不规则抗体的阳性检出率为0.25%,检出的5例均为Rh血型免疫性抗体,其中抗-E2例、抗-C1例、抗-Ce2例。结论采用木瓜蛋白酶-抗痛素法检测红细胞不规则抗体灵敏度高、价廉、快速,易于开展,适合各级医院开展,可作为输血前受血者不规则抗体的常规检测技术。

3种巯基蛋白酶对去磷酸化牛乳β-酪蛋白和茶黄素复合膜的清除

目的:采用茶黄素(theaflavin,TF)和去磷酸化牛β-酪蛋白(dephosphorylated bovineβ-casein,Dβ-CN)在芯片表面形成蛋白质/色素复合膜的模型,评估3种巯基蛋白酶(cysteine proteases,CPs),木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶,对Dβ-CN/TF复合膜的清除作用。方法:在消散石英晶体微天平(quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)上建立Dβ-CN/TF复合膜,Boltzman方程评估3种CPs水解复合膜的效率,水解前后膜变化通过原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)和接触角表征。结果:3种CPs水解复合膜的效率由大到小依次为无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶(P<0.05)。AFM图和接触角表征结果证实,CPs能够有效地清除结合在Dβ-CN表面的TF。结论:CPs具有在牙色渍清除中潜在的应用价值。在开发口腔保健产品中该类酶值得进一步研究。

酪蛋白酶解液组成及低丰度磷酸肽的LC-MS/MS分析

酪蛋白酶解液是营养型食品增鲜剂,其组成与鲜味关联度极大。该文采用溶胶-凝胶法合成高比表面积的多孔钛胶微球,并首次用于酪蛋白酶解液和低丰度磷酸肽的分离富集及液相色谱-串联质谱(liquid chromatographytandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析。结果表明:酪蛋白酶解液主要是由16种小肽和游离氨基酸组成,其中2种为磷酸肽,即Val-Asn-Glu-Leu-SerP^(*)-Lys和Thr-Val-Asp-Met-Glu-SerP^(*)-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys。该研究提出了一种不经单体分离和纯化过程,直接分析鉴定复杂混合物中低丰度多肽及磷酸肽的新方法,其有望在蛋白质、肽及营养组学等领域发挥重要作用。

胰蛋白和木瓜蛋白酶酶解酪蛋白产物的免疫活性

通过给小白鼠注射胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解酪蛋白产物,测定免疫器官重量、外周血白细胞数和E-玫瑰花环形成率研究酶解产物的免疫活性.结果发现两种酶的酶解物对由环磷酰胺所引起的免疫器官重量下降以及白细胞数的减少具有一定的抑制作用;并且两种酶解物也能够抑制环磷酰胺所引起的花环形成率下降.提示两种酶的酶解物对小鼠的免疫活性可能具有增强趋势.

溶胶-凝胶法固定化木瓜蛋白酶的活性保护

选择糖和脂质体作为溶胶-凝胶法固定木瓜蛋白酶(Papain)过程中的保护剂.研究了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、麦芽糖及构成脂质体的正癸烷溶液中胆固醇含量、卵/胆比等因素对固定化酶活性的影响.结果表明,80μL20mg/mLPapain溶液与15mg木糖、500μL正癸烷溶液[溶有1.5%(ω)胆固醇,卵磷脂/胆固醇质量比为4.5:1]充分混合后制备的固定化酶活性最高.在优化条件下制备的固定化酶包封率为42.0%,活力回收率为61.2%.SEM分析表明,固定化酶形态呈球状且大小均匀,内孔分布呈蜂窝状.破膜剂对固定化酶活性发挥的影响研究表明,TritonX-100的效果最好.

阳和汤对兔膝骨关节炎木瓜蛋白酶模型IL-1、TNF-α的影响

目的:观察阳和汤对兔膝骨关节炎模型中白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,探讨阳和汤防治骨关节炎的作用机制。方法:选取4~6月龄健康新西兰兔32只,雌雄各半,体质量(2.25±0.25)kg;采用随机数字表法分为对照组、模型组、阳和汤组、筋骨痛消丸组,每组8只。适应性饲养2周后,除对照组外,其余3组均采用关节腔内注入木瓜蛋白酶复制膝骨关节炎兔模型:轻度弯曲兔膝关节,经关节正中或两侧进针,将1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5 mL通过髌上韧带注入膝关节腔,每隔3天注射1次,连续3次。对照组与模型组予0.9%生理盐水灌胃;阳和汤组予6 g/(kg·d)阳和汤灌胃;筋骨痛消丸组予6 g/(kg·d)筋骨痛消丸灌胃。以上干预均1次/d,每周7次,共干预5周。停药1周后,处死全部实验动物,取兔股骨内髁关节软骨,采用肉眼、光镜下进一步观察苏木素-伊红染色后的关节软骨组织形态学改变情况;采用改良Mankin's评分标准评价软骨退变程度;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清和关节液中IL-1、TNF-α含量。结果:与对照组比较,模型组兔的软骨表面凹凸不平、局部缺损,软骨形态结构紊乱,软骨细胞数量减少,潮线紊乱消失,Mankin's评分增高,血清和关节液中IL-1、TNF-α含量增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,阳和汤组、筋骨痛消丸组兔的软骨缺损减轻,软骨形态结构较整齐,软骨细胞数量增多,潮线清晰,Mankin's评分降低,血清和关节液中IL-1、TNF-α含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与筋骨痛消丸组比较,阳和汤组兔的软骨形态结构未见明显区别,血清和关节液中IL-1、TNF-α含量无明显区别,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:阳和汤对骨关节炎的软骨损伤具有修复作用,能有效延缓关节软骨退变,其作用机制可能与抑制IL-1、TNF-α等炎性因子表达有关。

特异性水解α_(s1)-酪蛋白过敏原IgE作用表位aa 83~105的蛋白酶筛选

探索特异性水解α_(s1)-酪蛋白作用表位的蛋白酶筛选方法。首先通过固相合成法合成α_(s1)-酪蛋白作用表位aa 83~105,纯化鉴定后,偶联牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)制备完全抗原,然后免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,进而建立间接竞争酶联免疫吸附测定方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),以α_(s1)-酪蛋白制备的单克隆抗体及建立的方法为对照。结果表明:合成作用表位的纯度在90%以上,与BSA偶联比为6.31。单克隆抗体的亚型为IgG_(1),效价可达到1∶320 000,可以与α_(s1)-酪蛋白发生特异性免疫反应,与大豆蛋白无交叉反应。建立的间接竞争ELISA,竞争抑制曲线回归方程为y=-9.22x+100.78(R^(2)=0.989 1),方法重复性、精确性均较好,检出限低于α_(s1)-酪蛋白单克隆抗体建立的方法,初步筛选到木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解液的抗原残留量较小,需要进一步通过体内实验验证结果。α_(s1)-酪蛋白作用表位aa 83~105 G_(1)型单克隆抗体制备成功,为新型α_(s1)-酪蛋白作用表位aa 83~105低致敏配方粉的开发,提供了ELISA检测高灵敏专用单克隆工具抗体。

木瓜蛋白酶对MPA诱导的单核细胞分泌和黏附功能的抑制作用及分子机制初步研究

目的:观察木瓜蛋白酶对单核细胞-血小板聚集物(MPA)诱导的单核细胞分泌和黏附功能的抑制作用,并初步探讨其分子机制。方法:分离人外周血单核细胞和富血小板血浆(PRP),检测20 U/L木瓜蛋白酶不同作用方式下凝血酶和花生四烯酸(AA)诱导的MPA形成及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。将实验分为0(对照)、20、80U/L木瓜蛋白酶组,分别以ELISA、流式细胞术和显微镜检查测定木瓜蛋白酶与单核细胞共孵育后MPA诱导的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和组织因子(TF)释放、CD11b和CC趋化因子受体2(CCR2)表达水平以及单核细胞与人脐静脉内皮细胞黏附率,再以Western blot检测单核细胞Akt磷酸化(p-Akt)和环氧化酶-2(COX-2)表达水平。结果:20 U/L木瓜蛋白酶与单核细胞和血小板共孵育时显著降低凝血酶和AA诱导的MPA形成和TNF-α水平(P<0.01)。20 U/L木瓜蛋白酶组MCP-1和TF水平,CD11b和CCR2表达率,单核细胞与内皮细胞黏附率均显著低于对照组(P<0.01),80 U/L组对五者的抑制率显著高于20 U/L组(P<0.01)。木瓜蛋白酶显著抑制pAKT和COX-2表达,80 U/L组p-Akt和COX-2光密度比值显著低于20 U/L组(P<0.01)。结论:木瓜蛋白酶可通过抑制Akt磷酸化和COX-2表达途径而抑制MPA诱导单核细胞活化后的释放和黏附功能,从而可能有助于预防动脉粥样硬化。

盐析法联合离子液体双水相纯化木瓜蛋白酶

本实验以海南产番木瓜为研究对象,采取盐析法联合离子液体双水相对其富含的木瓜蛋白酶进行提取纯化。以不同饱和度的(NH_4)_2SO_4对粗酶液进行盐析,通过实验结果分析,确定了以饱和度分别为20%和45%的两步盐析法的最佳条件。然后再进行双水相萃取,通过单因素试验结果设计3因素3水平的响应面试验,优化双水相萃取条件为离子液体[C_4mim]N(CN)_2质量分数29.76%、(NH_4)_2SO_4质量分数16.08%、pH 8.18,在此最优条件下木瓜蛋白酶萃取率为89.01%,酶活力回收率为86.72%,所得到木瓜蛋白酶比活力为1 056 U/mg,纯化倍数达到9.6倍。然后对实验产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,经纯化的酶中杂条带明显减少,验证了分离纯化的效果。

木瓜蛋白酶对MPA形成及其诱导的单核细胞活化的影响

目的:观察木瓜蛋白酶对单核细胞-血小板聚集物(MPA)形成及其诱导的单核细胞活化的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法:分离单核细胞和富血小板血浆(PRP),将实验分为3组:0、20、80U/L木瓜蛋白酶组,分别测定不同浓度木瓜蛋白酶与单核细胞和血小板(PLT)共孵育后以及木瓜蛋白酶与血小板单独孵育后MPA形成、P-选择素和CD11b表达水平,木瓜蛋白酶与单核细胞孵育后的MPA形成和CD11b表达水平,计算各浓度木瓜蛋白酶对MPA和CD11b的抑制率。结果:随药物浓度增加,木瓜蛋白酶与单核和PLT共孵育后以及木瓜蛋白酶与血小板单独孵育后MPA形成、P-选择素和CD11b表达水平显著降低,木瓜蛋白酶与单核细胞单独孵育后MPA形成和CD11b表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01或0.001)。各处理组中,80U/L组对MPA和CD11b的抑制率均显著高于20U/L组(P<0.01),木瓜蛋白酶与血小板和单核细胞共孵育组MPA和CD11b抑制率均显著高于其余两组,差异均有统计学意义(P<0.001)。结论:木瓜蛋白酶可通过抑制血小板P-选择素表达和单核细胞与血小板结合途径而对MPA形成及其诱导的单核细胞活化有抑制作用,这可能作为其可应用于抗血栓和动脉粥样硬化防治的新机制。

催化共振散射光谱法测定木瓜蛋白酶活力(英文)

木瓜蛋白酶催化水解酪蛋白生成小分子氨基酸和肽，剩余底物酪蛋白与三氯乙酸结合形成粒径约为1740nm的缔合物微粒。该微粒在360、400、420、470、520nm处产生5个共振散射峰，其中最强峰位于470nm。在选定条件下，随着木瓜蛋白酶量的增加，体系中剩余酪蛋白浓度降低，470nm处的共振散射光强度，Ⅰ470nm降低。木瓜蛋白酶的酶活力在0．024～4．8 USP／mL范围内与470nm处的共振散射光强度降低值△Ⅰ470nm呈现良好线性关系，检出限为0．0083 USP／mL。该共振散射光谱法用于嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力测定，结果满意。