木糖代谢基因表达水平对酿酒酵母重组菌株产物形成的影响

以Ｅ．ｃｏｌｉＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ穿梭质粒ＹＥｐ２４为骨架，将树干毕赤酵母（ＰｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓＣＢＳ６０５４）的木糖还原酶（ＸｙｌｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅＸＲ）基因ＸＹＬ１及木糖醇脱氢酶（ＸｙｌｏｌｉｔｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＸＤＨ）基因ＸＹＬ２分别以不同的相对表达方向置于酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ｉ（ＡＤＨ１）启动子和磷酸甘油激酶（ＰＧＫ）启动子下，构建不同ＸＹＬ１及ＸＹＬ２的重组质粒。这些重组质粒分别转化酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨ１５８）受体菌。得到的重组菌株表现出不同的基因表达水平，ＸＲ与ＸＤＨ的酶比活力比值即ＸＲ／ＸＤＨ的变化范围在００６～１７５之间。当ＸＹＬ１或ＸＹＬ２受ＰＧＫ１启动子控制同时位于ＡＤＨ１启动子下游时，检测到最高的酶比活力。为了加强对木糖的利用，在ＸＹＬ１、ＸＹＬ２基因的酵母重组菌株中又引入磷酸戊糖途径中的转醛酶（Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ）基因ＴＡＬ１及转酮酶（Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ）基因ＴＫＬ１，使酵母菌在原有水平的基础上超表达合成转酮酶及转醛酶。同时具有ＸＹＬ１和ＸＹＬ２以及超表达基因ＴＡＬ１、ＴＫＬ１的酵母重组菌株可以在木糖为唯一碳源平板?

酿酒酵母中的嗜热细菌木糖异构酶活性表达及木糖代谢研究

将来自嗜热放线细菌Thermobif ida f usca的木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xylA,连接于酵母表达载体pYES2的半乳糖诱导启动子(PGAL)下,得到重组质粒pYES2-xylA,用其转化酵母菌INVSc1,测定重组酵母菌株INVSc1-xylA的木糖异构酶活性,并对重组酵母菌株进行木糖葡萄糖共发酵试验,探讨在酿酒酵母中建立新的生产乙醇木糖代射途径。结果木糖异构酶在75℃,pH值6.8的酶活力最高,在酿酒酵母中成功地获得活性表达,并且SDS-PAGE电泳有明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。INVSc1-xylA在木糖葡萄糖共发酵实验中消耗木糖和产生乙醇分别比对照菌提高53.8%和36%,提高了其生产乙醇的能力。

小儿厌食颗粒对厌食小儿唾液淀粉酶和尿D-木糖代谢率的影响

目的观察小儿厌食颗粒对厌食症小儿尿淀粉酶活性及尿D-木糖代谢率的影响。方法治疗组35例采用小儿厌食颗粒治疗,对照组32例采用葡萄糖酸锌口服液治疗,疗程均为15 d;分别于基线点和研究终点测定尿淀粉酶活性和尿D-木糖代谢率。结果治疗组治疗后两项指标均比治疗前显著增加,有显著性差异(P<0.01);对照组治疗后,尿淀粉酶活性比治疗前有所增加,有显著性差异(P<0.05),尿D-木糖代谢率与治疗前相比无明显差异(P>0.05)。两组在提高2项指标疗效方面有显著性差异(P<0.05)。结论小儿厌食颗粒对厌食小儿具有较好的指标疗效。

木糖代谢酶系基因的克隆与表达

自然界中,许多细菌和一些酵母、丝状真菌都能利用木糖。在原核生物中,木糖代谢一般须有三种酶参与,即木糖通透酶、木糖异构酶和木酮糖激酶。在木糖通透酶作用下,木糖进入细胞,然后被木糖异构酶异构化为木酮糖。

微生物共利用木糖和葡萄糖生产化学品研究进展

木质纤维素生物质是储量丰富的可再生资源,在能源、化工及医药领域具有广阔的应用前景。木质纤维素各组分因氢键和共价键的存在而结合紧密,需经酸、碱、高温、有机溶剂等预处理后才能高效酶解利用,其水解产物的主要成分为己糖(60%~70%,葡萄糖为主)和戊糖(30%~40%,木糖为主)的混合物。本文主要针对水解液中木糖和葡萄糖的共利用效率相关问题,以基因工程改造微生物利用木糖和葡萄糖共发酵生产醇类、生物油脂、γ-聚谷氨酸及有机酸等生物基化学品为主线,从代谢途径重构、基因水平调控及发酵技术优化等方面综述了近年来的研究进展。最后,从菌株筛选、基因与代谢工程调控、细胞固定化、产物处理及发酵工艺等层面总结了该领域目前的研究特点、技术瓶颈和未来的研究方向与思路。

罗氏真养菌W50的D-木糖代谢途径工程改造

【目的】拓宽高产聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)W50的碳源使用范围,使其获得D-木糖代谢能力。【方法】运用PCR技术扩增大肠杆菌(Escherichia coli)K-12W3110来源的D-木糖转运蛋白基因xylE,利用同源重组技术将xylE基因整合到R.eutropha W50的染色体上构建菌株W50-E。运用PCR技术扩增E.coli K-12 W3110来源的D-木糖代谢基因xylAB和R.eutropha H16来源的PHA合酶基因phaC1的启动子片段P pha C1,同表达载体连接后构建重组质粒p1-AB。将重组质粒分别转入菌株R.eutropha W50和W50-E中构建工程菌株W50-AB和W50-EAB。通过摇瓶发酵研究W50-AB和W50-EAB的D-木糖代谢特性。【结果】酶活分析结果表明,xylA和xylB基因在菌株R.eutropha W50中得到表达。摇瓶发酵结果表明,W50-AB在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中的最大比生长速率为0.025 h-1,在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中没有生长;W50-EAB在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中表现出一定生长,在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中最大比生长速率为0.035 h-1。PHB含量分析结果表明,摇瓶发酵终点时,W50-AB和W50-EAB菌株内的PHB含量分别为细胞干重的15.07±1.01%和15.07±1.64%,其相应的D-木糖-PHB转化率分别为0.0920 g·g-1和0.0838 g·g-1,低于两重组菌株利用葡萄糖发酵的糖-PHB转化率(>0.22 g·g-1)。另外,重组菌株W50-AB和W50-EAB在含葡萄糖(0.01 mol/L)和D-木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养基中的发酵结果表明,两重组菌株均表现出更高的生长速率和D-木糖消耗速率以及胞内PHB积累量。【结论】来源于E.coli K-12W3110菌株的xylAB基因的表达使R.eutropha W50获得了一定的D-木糖代谢能力,通过D-木糖转运蛋白基因xylE的表达能提高菌株的D-木糖代谢能力,同时重组菌株利用D-木糖能积累一定量PHB。

重组菌Ralstonia eutropha W50-EAB D-木糖代谢相关的限速靶点

【目的】通过代谢工程改造真养罗氏菌(Ralstonia eutropha)W50-EAB木糖代谢的相关限速靶点,进一步提高R.eutropha W50-EAB的D-木糖利用效率,为获得高效利用纤维素水解液的菌株奠定基础。【方法】利用PCR技术扩增R.eutropha转酮酶基因tkt A,cbb T2和转醛酶基因tal,将扩增的tkt A,cbb T2和tal基因分别构建到表达载体p BBR1MCS-3上,获得重组质粒p WL1-TKT,p WL1-CBBT2,p WL1-TAL。通过电转的方式将质粒分别转化W50-EAB获得重组菌W50-KAB,W50-CAB和W50-TAB。利用基因敲除的方法,获得醛还原酶基因h16_A3186敲除株W50'-EAB。通过电转的方式将重组质粒p WL1-TAL导入敲除株W50'-EAB获得重组菌株W50'-TAB。通过摇瓶发酵研究重组菌株W50-KAB,W50-CAB,W50-TAB,W50'-EAB以及W50'-TAB的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,转酮酶和转醛酶基因实现表达。摇瓶发酵结果表明,转酮酶基因过表达菌株W50-KAB和W50-CAB相比于对照菌株W50-EAB/p3,表现出降低的木糖利用能力;而转醛酶基因过表达重组菌株W50-TAB以及敲除菌株W50'-EAB对木糖的利用得到一定的提高。在0.1 mol/L木糖的发酵培养基中,W50-EAB的最大比生长速率为0.035 h-1,PHB干重比为16.2±1.01%;而W50-TAB的最大比生长速率提高到0.039 h-1,PHB干重比达到20.5±0.76%;醛还原酶基因敲除菌株W50'-EAB最大比生长速率提高到0.040 h-1,PHB含量提高到19.8±1.05%。结果显示转醛酶基因的过表达与醛还原酶基因的敲除对木糖利用均表现出一定的优势,将这两种优势组合获得菌株W50'-TAB,摇瓶发酵分析结果为最大比生长速率达到0.042 h-1,PHB积累达到27.9±0.47%,相比于对照菌株提高了72.2%。另外,在含有葡萄糖(0.01 mol/L)和木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养下,重组菌株W50-TAB,W50'-EAB和W50'-TAB相比于在纯木糖培养下都表现出更高的生物量和胞内PHB积累量。【结论】磷酸戊糖途径关键酶转醛酶基因的过表达加速了木糖代谢流,从而可以高效利用木糖积累一定量的PHB。醛还原酶对木糖代谢有阻碍作用,敲除该酶基因后木糖代谢能力有了一定的提高,而两者协同作用可以进一步提高重组菌株的木糖利用效率和PHB积累能力。

转录因子MtlR介导嗜热厌氧杆菌SCUT27木糖代谢途径的激活

[目的]探究嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27(SCUT27)木糖代谢途径的调控机制,强化葡萄糖和木糖共利用。[方法]通过q PCR、RT-PCR对木糖代谢相关基因xyl A、xyl B和xyl T的共转录及功能进行验证,然后利用基因敲除技术构建rok、lac I和mtlR的敲除菌,以探究其对木糖代谢的调控,最后构建mtlR的过表达菌株,强化葡萄糖和木糖的共利用。[结果]RT-PCR结果显示xyl A、xyl B和xyl T共转录;敲除xyl AB后,木糖利用能力下降83.72%;当敲除rok和lac I后,木糖利用能力变化不显著;敲除mtlR后,木糖利用能力下降67.56%,xyl AB和xyl T的转录水平分别下降约39.67%和86.93%。过表达mtlR后,xyl AB的转录水平提高约44.75%,木糖利用能力提高25.71%。[结论]转录因子MtlR是SCUT27木糖代谢的正调控因子,过表达mtlR可强化SCUT27的葡萄糖和木糖共利用。

嗜热细菌木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中的高效表达

采用ＰＣＲ技术克隆得到嗜热细菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ木糖异构酶（ｘｙｌｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅＸＩ）基因ｘｙｌＡ，将该基因连接于酵母表达载体ｐＭＡ９１的磷酸甘油激酶（ＰＧＫ）启动子下，得到重组质粒ｐＢＸ１。通过ＬｉＡｃ完整细胞转化法将重组质粒转移至酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈ１５８受体菌中，得到重组酵母转化子Ｈ６１２，酶活测定结果表明，成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果显示出明显的特异性表达产物带，单体分子量为４３ｋＤ。由酿酒酵母重组子Ｈ６１２产生的木糖异构酶最高酶活条件与其在自然状态下的一致，均为８５℃，ｐＨ７０，在这一条件下酶的比活力为１０Ｕ／ｍｇ蛋白，而在接近酵母最适生长温度的３０℃和４０℃时，其相对酶活分别下降３７％和１１％。研究结果显示在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达，为进一步在酿酒酵母菌中建立新的木糖代谢途径打下了基础。

表达异源木糖异构酶对谷氨酸棒杆菌利用木糖的影响

微生物细胞木糖代谢对生物质水解液全利用和促进特定重要化学品的合成具有重要意义.谷氨酸棒杆菌为重要的氨基酸工业生产菌株,由于缺乏木糖异构酶编码基因而不能代谢木糖.本研究通过质粒过表达不同来源的木糖异构酶基因xyl A,实现了菌株对木糖的利用,其中大肠杆菌木糖异构酶效果最好.由于木糖异构酶的活性是制约菌株代谢木糖的瓶颈因素,因此对启动子的SD序列进行了替换以促进翻译效率,使菌株在木糖培养基中生长的A600值达到出发菌的2.7倍.通过基因组整合3个拷贝的优化后xyl A表达模块,实现了无质粒的木糖代谢工程菌株的构建,为后续谷氨酸棒杆菌利用木糖生产高附加值化学品的代谢工程研究奠定基础.

酵母发酵生产木糖醇的研究

木糖醇是一种天然存在的糖醇,通过化学方法目前已经实现了规模化生产。近几年科研人员对发酵生产木糖醇的关注度很高,因为由半纤维素水解得到的木糖料液直接发酵生产木糖醇,具有工序步骤短、产品更天然、生产安全容易保障的优点。要发酵生产木糖醇,首先微生物必须能够利用木糖,从国内外的研究来看,酵母在发酵生产木糖醇方面具有很大的优势。本文主要综述了木糖在酵母细胞中的运输与代谢、影响发酵生产木糖醇的因素,以及优化发酵生产木糖醇的方法。

CIT2基因对突变酿酒酵母木糖利用影响的研究

木糖利用困难是秸秆燃料乙醇产业化的制约因素,改造酿酒酵母使其能够代谢木糖生成乙醇是当前研究的热点之一。为了研究CIT2基因对遗传改良酿酒酵母C5D-P-M菌株中葡萄糖与木糖共发酵过程中木糖利用的影响,设计引物并应用重叠PCR技术获得敲除CIT2基因的敲除组件,通过同源重组的方法将C5D-P-M中的CIT2基因敲除得到突变菌株C5D-P-M-CIT2Δ。通过对出发菌株和突变菌株的生长速率、葡萄糖利用率、木糖利用率及乙醇产量进行研究,结果表明突变菌株C5D-P-M-CIT2Δ的上述指标比出发菌株C5D-P-M均有一定程度的提高。因此推测,酿酒酵母中CIT2基因是影响木糖利用的因素之一,CIT2基因的敲除可提高酿酒酵母的木糖利用率。

酿酒酵母转录因子Ask10p的研究进展

酿酒酵母的转录因子Ask10p又称Rgc2p,作为RNA聚合酶II全酶的一个组分参与调节氧化应激反应,还可以作为水甘油通道蛋白Fps1p的正调节因子调节胞内渗透压平衡,近年来随着研究的不断深入,Ask10p已被证实在氧化应激、渗透压胁迫、热激胁迫和木糖代谢等方面发挥重要的调节作用,本文将概述Ask10p在酿酒酵母中的生物学功能及研究进展,并对其未来研究提出展望,以期为今后的研究提供理论参考。

不同宿主来源的重组酿酒酵母混合糖代谢比较

【目的】研究不同工业酿酒酵母宿主背景对重组酵母木糖利用效率的影响。【方法】将木糖利用途径的木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)编码基因串联后分别转入3株不同的工业酿酒酵母中,得到重组酵母ZQ1、ZQ5和ZQ7。分别对3个木糖途径代谢基因的表达水平、酶活和重组菌株的木糖发酵效率进行比较。【结果】重组菌株在木糖代谢基因转录、酶活性和木糖利用性能方面有很大差异,其中ZQ5木糖代谢能力最强,ZQ7其次,ZQ1木糖利用能力最弱。ZQ7在初始木糖浓度为20 g/L时木糖利用速率快于ZQ5,表明木糖浓度对重组菌发酵性能评价具有影响。【结论】不同菌株的遗传背景和木糖浓度对重组菌木糖利用的影响很大,评价重组酵母的木糖利用需考虑宿主的遗传背景和底物浓度的影响。

休哈塔假丝酵母转化木糖和葡萄糖为乙醇的发酵转录谱

【目的】探究木糖发酵典型菌株休哈塔假丝酵母在己糖和戊糖发酵中的转录谱及差异,筛选出与木糖利用和乙醇发酵代谢途径及调控相关的关键性酶和功能蛋白质基因。【方法】应用新一代高通量测序技术454 GS FLX Titanium分别构建了休哈塔假丝酵母木糖、葡萄糖发酵的cDNA文库,并进行De novo转录组的表达序列标签大规模测序和序列比较分析,进而挖掘出该酵母中参与木糖代谢和乙醇发酵的相关基因。【结果】分别对木糖和葡萄糖发酵样本进行二分之一RUN测序并各自得到60万条reads,序列平均长度400 bp。共拼接得到7250条(木糖)和7168条(葡萄糖)contigs,并利用BLAST对木糖样品和葡萄糖样品中的2421个基因(contig)和2456个基因(contig)进行了功能注释和GO分类。通过两个文库间的序列对比分析,共发现158个基因属于差异表达状态(P<0.05)。基于经典的糖酵解及乙醇发酵途径筛选出与木糖乙醇发酵相关的候选基因,并且比较分析其转录水平的差异。【结论】基于大规模转录谱测序和比较分析首次筛选出休哈塔假丝酵母中参与木糖代谢和乙醇发酵的基因群,可为后续的分子生物学及代谢调控研究提供基础数据。

木糖醇

木糖醇是一种五碳糖醇,为白色晶体或白色粉末状晶体,是木糖代谢的正常中间产物,广泛存在于果品、蔬菜、谷类、蘑菇等食物中。木糖醇入口后往往伴有微微的清凉感,这是因为它易溶于水,并在溶解时会吸收一定热量。常温下木糖醇甜度与蔗糖相当,低温下甜度为蔗糖的1.2倍。

木糖醇

木糖醇是一种五碳糖醇，为白色晶体或白色粉末状晶体，是木糖代谢的正常中间产物，广泛存在于果品、蔬菜、谷类、蘑菇等食物中。

构建微生物细胞工厂利用木糖合成高值化学品

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源。以木质纤维素为原料利用微生物细胞工厂合成高附加值化学品是实现绿色生物制造的关键。木糖是木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的第二大可发酵糖,因此构建可高效代谢木糖的微生物细胞工厂对于实现木质纤维素的全利用具有重要意义。然而与葡萄糖相比,大多数微生物代谢木糖的效率较低,限制了木糖的应用。近年来,微生物代谢机制的深入理解和合成生物学技术的不断进步极大地提高了微生物代谢木糖的效率,拓展了木糖衍生产品的种类。本文综述了自然界存在的几条木糖代谢途径及其衍生的相关产品,总结了构建木糖和葡萄糖共利用菌株的策略,概括了利用木质纤维素水解产物合成目标产品的研究进展,并对相关技术瓶颈和未来发展方向进行了讨论与展望。