靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ(XT-Ⅰ)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT-Ⅰ基因序列,设计短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链DNA片段,克隆到Pgenesil-1载体中,构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,行酶切及核酸测序鉴定;将构建的XT-Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测转染效率,并采用半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT-Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实,构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确;转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光;流式细胞术测定转染效率平均为50.26%;RT-PCR结果显示,WJ3显著抑制XT-Ⅰ mRNA的表达,抑制率为72.39%;Western blot结果显示,WJ3有效抑制XT-Ⅰ的蛋白表达,抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT-Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,其中WJ3可高效抑制XT-Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达,为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。

油菜糖基转移酶BnIRX14基因家族鉴定及遗传转化

糖基转移酶在植物抗逆和发育调控中发挥着重要作用,为发掘糖基转移酶BnIRX14基因家族成员,解析在甘蓝型油菜中的生物学功能,该研究利用前期在甘蓝型油菜中克隆到的BnIRX14基因,采用序列比对和遗传转化的方法,进行BnIRX14基因家族成员鉴定和功能验证,以探讨BnIRX14基因家族在油菜发育中调控机理,为油菜杂交育种和抗逆育种提供理论依据。结果表明:(1)经基因组数据库比对分析在甘蓝型油菜中成功鉴定到3个糖基转移酶不同亚家族的11个BnIRX14家族成员,它们均具有糖基转移酶GT43家族成员结构域特征,其中有8个基因分别被定位在6条不同染色体上,3个亚家族在基因结构和保守元件中具有较大特异性。(2)利用农杆菌介导转化法,获得BnIRX14基因RNA干扰转基因油菜株系20株,经PCR检测,确定5株阳性转化体。(3)表型鉴定发现,有2株阳性转化株的花柱头至花柱中央为一孔状空腔,子房较野生型明显膨大,且柱头表面授粉后不能结实,表现雌性不育;其他3个阳性株花器结构发育正常,但植株茎、枝表皮有液体渗出,呈露珠状粘附在茎、枝表面。(4)实时荧光定量PCR分析显示,转BnIRX14基因油菜阳性植株花、角果、叶中的BnIRX14基因表达量均显著低于野生型,且9#阳性不育株的角果中BnIRX14基因表达低于其他转基因干扰株系,说明BnIRX14基因在干扰转化阳性植株中的表达受到显著抑制。研究推测,BnIRX14基因可能参与油菜雌蕊的发育和次生物质代谢。

青花菜β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因的克隆及在模拟酸雨胁迫下的表达分析

由糖基转移酶催化产生的次生代谢物质对植物抵御和适应环境的变化起着重要作用。为探讨青花菜在酸雨胁迫下糖基转移酶的表达变化,对青花菜β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因的cDNA序列全长进行克隆,并对其进行生物信息学和表达分析。结果表明:青花菜β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因的cDNA全长为1 550 bp,开放阅读框为1 155 bp,编码384个氨基酸,推测分子式为C1964H3044N558O567S11,分子量为43 897.8,没有信号肽。系统进化树分析结果表明,该青花菜基因与拟南芥聚类关系最近。利用实时荧光定量PCR研究模拟酸雨胁迫下β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达量,结果显示该基因的表达量在模拟酸雨胁迫初期显著增大,随着时间的延长,又开始下降,这表明其在青花菜抗酸雨胁迫中发挥了作用。

阿霉素肾病模型鼠肾组织木糖基转移酶和乙酰肝素酶基因的表达

目的研究肾病模型鼠肾组织木糖基转移酶(xylosyltransferase,XT-Ⅰ)和乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)基因表达水平并观察其与尿蛋白量的关系。方法将大鼠随机分为正常对照组、肾病模型7d组、14d组、21d组,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对4组大鼠肾组织中XT-Ⅰ、Hpa基因表达进行半定量研究,并观察其与尿蛋白量的关系。结果肾病模型7d组、14d组、21d组与正常对照组之间比较,XT-Ⅰ表达量增加(P<0.05),肾组织XT-Ⅰ表达水平增高与尿蛋白的增加呈正相关关系(r=0.760,P<0.05);肾病模型7d组、14d组、21d组与正常对照组之间比较,HPa表达量增加(P<0.05),各组肾组织HPa表达水平增高与尿蛋白的增加呈正相关关系(r=0.757,P<0.05)。结论Hpa在大鼠肾病模型蛋白尿的产生中起重要作用,同时,XT-Ⅰ的增加可能导致硫酸乙酰肝素(HS)的合成增加。

沉默XT-I基因阻抑蛋白多糖合成与唾液腺多形性腺瘤侵袭性的抑制

目的探讨唾液腺多形性腺瘤(pleomorphic adenoma,PA)中蛋白多糖(proteoglycans,PGs)阻抑后,对肿瘤侵袭性生物学行为的抑制。方法(1)构建靶向沉默木糖基转移酶基因-I(xylosyltransferase-1,XT-1)的质粒载体shRNA-WJ4。(2)留取1例腮腺原发性多形性腺瘤标本,进行组织学和免疫组织化学染色,采用鼠抗人Hyaluronan synthase 2(HAS2)检测透明质酸,鼠抗人Heparan Sulfate Proteoglycan检测硫酸乙酰肝素。(3)原代细胞培养,采用兔抗人calponin,鼠抗人S-100蛋白和CK7单克隆抗体鉴定细胞。(4)脂质体转染培养的PA细胞,沉默XT-I基因。实验分三组,PA组(空白组)、PA-HK组(空载体组)、PA-WJ4组(沉默组),MTT法检测三组细胞的生长情况。(5)采用Real-Time PCR技术,检测基因沉默后XT-I基因的表达。(6)应用Blyscan Assay Kit试剂盒检测基因沉默后,PGs合成分泌的改变。(7)应用Transwell小室法检测基因沉默后,肿瘤细胞侵袭能力的改变。(8)统计学分析应用SPSS13.0统计分析软件,Excel软件导出数据,生成柱形图。结果(1)成功构建靶向沉默木糖基转移酶基因-I(XT-1)的质粒载体shRNA-WJ4。(2)唾液腺PA黏液软骨样组织中,富含透明质酸和硫酸乙酰肝素。(3)唾液腺PA原代培养5~7天,细胞从组织块周围爬出。培养的PA细胞鉴定发现,肿瘤性肌上皮细胞抗calponin阳性、抗S-100阳性;肿瘤性腺上皮细胞CK7阳性。(4)ShRNA-WJ4成功转染PA细胞后,表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),转染效率44.2%。MTT法检测显示,沉默组PA细胞生长缓慢。(5)Real-Time PCR检测沉默组PA细胞,XT-I基因mRNA沉默效率为28.0%。(6)应用Blyscan Assay Kit试剂盒,检测基因沉默48 h后,沉默组PA细胞PGs合成分泌降低27.20%。(7)Transwell侵袭试验显示,沉默组PA组细胞穿过微孔膜到达下层的细胞数量为23.83±2.93个,较空载体组(64.50±3.94)和空白组(67.50±2.35)细胞明显减少(P<0.01),侵袭抑制率为64.70%。结论靶向沉默XT-I基因,有效阻抑PA细胞的PGs合成,成功有效抑制PA细胞的侵袭性生物学行为。

菘蓝木脂素类糖基转移酶基因IiUGT349克隆及功能表征

对菘蓝转录组数据进行系统挖掘,获得110条假定糖基转移酶。利用原核表达和体外酶促体系,获得了1条新的木脂素糖基转移酶基因,暂命名为IiUGT349。活性检测发现IiUGT349能催化落叶松树脂醇生成落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷和落叶松树脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷。生物信息学分析表明,IiUGT349的开放阅读框(ORF)为1 401个碱基,编码467个氨基酸,编码的蛋白质理论等电点为5.96,相对分子质量为52.77 kDa。系统发育树分析显示IiUGT349和已报道的木脂素糖基转移酶同源性较低,归属于UGT90家族,可能代表了一类新的木脂素糖基转移酶。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示IiUGT349在根、茎、嫩叶和叶中均表达,其中在茎中表达量最高。体外酶促反应显示IiUGT349对落叶松树脂醇最佳反应时间为12 h,最佳反应温度为45℃。亚细胞定位发现IiUGT349定位于植物细胞质和细胞核中。该研究克隆得到了1条新的属于UGT90家族的木脂素糖基转移酶IiUGT349,为深入研究此关键酶基因功能和菘蓝木脂素糖苷生物合成途径奠定了基础,对木脂素糖苷活性成分的合成生物学研究有重要意义。

霍山石斛β-1,4-木糖基转移酶(IRX9)基因克隆及生物信息学分析

目的克隆霍山石斛β-1,4-木糖基转移酶(IRX9)基因,并进行生物信息学、密码子偏性分析。方法根据霍山石斛转录组数据获得的IRX9基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术得到IRX9基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果霍山石斛IRX9基因全长1 553 bp,包含一个长度为1 047 bp的开放阅读框,编码348个氨基酸,理论相对分子质量为39 350,等电点为7.26,为不含信号肽的亲水性稳定蛋白,定位于质膜,具有多个磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树表明,该序列与同科植物铁皮石斛的同源性最高,且具有GT-A超家族的保守区域"DXD"。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有27个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆IRX9基因,为从分子水平调控霍山石斛的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。