内切木聚糖酶与木糖苷酶预处理对麦草浆漂白性能的影响

研究了内切木聚糖酶与木糖苷酶预处理对麦草浆漂白性能的影响。结果表明,无论是内切木聚糖酶还是木糖苷酶预处理漂白浆的白度均比对照浆高,分别高出对照浆的2.5和1.9个百分点,同时漂白浆的强度也好于对照浆的强度。内切木聚糖酶和木糖苷酶混合预处理漂白浆的白度分别比内切木聚糖酶和木糖苷酶高出0.9和1.5个百分点,这表明内切木聚糖酶和木糖苷酶在纸浆预处理过程中具有协同作用。通过电镜观察发现经内切木聚糖酶和木糖苷酶预处理后纸浆的表面和横断面有许多孔隙,其中经内切木聚糖酶预处理后纸浆的孔隙比木糖苷酶要多而且大。通过X 射线衍射分析发现内切木聚糖酶和木糖苷酶均不能破坏纸浆的结晶度。

一种来源于Leifsonia shinshuensis DICP 16菌体的β-D-木糖苷酶的分离纯化及其性质

采用盐析、DE52、Q-SepharoseFast Flow阴离子交换层析、Toyopearl Butyl 650C疏水层析以及Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析联用的方法,从Leifsonia shinshuensis DICP 16菌体中纯化出一种β-木糖苷酶。分离后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带,通过SDS-PAGE和凝胶过滤层析法,测得该酶是一个由两个分子量约为91kD的相同亚基组成的同源二聚体。其水解对硝基苯酚木糖苷（pNPX）的最适反应温度为55°C,pH值为7.0。该木糖苷酶在45°C以下,pH6.0-11.0之间具有很好的稳定性。在45°C,pH值为7.0的条件下,水解pNPX的Km,Vmax分别为1.04mmol/L,0.095mmol/（min·mg）。研究不同的金属离子对该酶的活性影响,发现Fe^2＋和Cu^2＋是很强的抑制剂。通过对天然木糖苷化合物的水解测试,发现该酶可以水解人参皂苷Rb3的木糖基,产生人参皂苷Rd,却不能水解紫杉烷木糖苷的木糖基。

β-木糖苷酶的研究进展

综述了β-木糖苷酶的性质、结构、催化机制和基因工程等方面的研究进展,并展望了该研究在能源工业、造纸工业和医药工业上的应用前景。

嗜热拟青霉木糖苷酶的性质及其与木聚糖酶的协同作用

嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18利用玉米芯能产胞外木糖苷酶,通过(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE-52离子交换层析及Q-琼脂糖凝肢-FF(QSFF)离子交换层析从上清液纯化得到了电泳纯的木糖苷酶,纯化倍数为31.9倍,回收率为2.27%。SDS-PAG E及Superdex-75凝胶过滤层析测定木糖苷酶的分子量分别为53.5 ku和51.8 ku。该酶最适温度及pH分别为55℃和pH 6.5。木糖苷酶能够水解木二糖和低聚木糖但不能水解木聚糖,水解低聚木糖的相对速率随聚合度增加而增加。该酶对木糖的抑制常数Ki值为139 mmol/L,具有很高的木糖耐受性。木糖苷酶与内源木聚糖酶一起水解木聚糖产生更多的还原糖,表现出协同作用。

微生物产β-木糖苷酶的研究进展

β-木糖苷酶是木聚糖类半纤维素水解酶系的重要组成部分,能够从还原端将木二糖等低聚木糖逐一降解为木糖,被应用于能源、造纸、医药等许多领域。分别从来源、分类、酶学性质、生产调控及基因的克隆等方面对β-木糖苷酶进行了综述,对其应用前景进行了展望,并对研究现存的问题和今后发展的方向进行了分析。

嗜热拟青霉产胞外木糖苷酶发酵条件的优化

嗜热拟青霉J18是由本实验室筛选并保存的拟青霉新种。该菌能够利用玉米芯为碳源、尿素为氮源液体发酵高产胞外β-木糖苷酶。单因素优化试验表明:5%的粒度为0.45mm～0.9mm的玉米芯、1%尿素、初始pH6.5、温度为45℃是最佳产酶培养条件。在优化后的条件下,培养5d产β-木糖苷酶的活力最高达3.15U/mL,比酶活为2.43U/mg。该菌所产的木聚糖酶和木糖苷酶协同作用可将桦木木聚糖完全降解成木糖,水解24h后,其水解液中还原糖含量比只加入电泳纯木聚糖酶的水解液提高了64%。

热稳定性α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的纯化

α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶对来源于被子植物的木聚糖类半纤维素的生物降解和转化是必不可少的。文中首次报道了国内对该酶的研究。α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因工程菌在发酵罐中以LB为基质进行生长 ,以乳糖为诱导剂 ,所产生的α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶在 70℃热处理 3 0min后、经DEAE Sephacel阴离子柱层析、金属Ni2 + 的亲和层析等提纯步骤 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 49 3倍 ,收率为 2 0 4%。SDS PAGE法测定α 阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的分子质量为 85ku 。

小麦麸皮内源性β-木糖苷酶酶活测定及酶学性质

以PNP—β—xylopyranoside为底物确定小麦麸皮内源性β-木糖苷酶的酶活力测定条件，并对β-木糖苷酶的酶学性质进行研究。试验确定酶活测定条件为底物浓度1mg／mL，提取液pH5。木糖苷酶的酶学性质：最适反应温度为60℃，在20～50℃时稳定性好，保温60min后其活力可保持在70％以上，最适pH值为5，在pH值5～6时对木糖苷酶的破坏力相对较小，保温60min后其活力仍可保持在80％以上。动力学参数Km和Vmax分别为4．518mg／mL，0．392μmol／（min·g）。通过对4种小麦麸皮酶活力进行测定发现：细麸中的β-木糖苷酶活性均高于粗麸，粗麸中郑麦8998的木糖苷酶酶活最大，细麸中花培8号小麦木糖苷酶活性最大。

里氏木霉β-木糖苷酶的分离纯化、酶学性质及水解机理研究

通过硫酸铵沉淀、超滤脱盐、离子交换层析、凝胶过滤层析等手段,从里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C-30木聚糖酶粗酶液中分离纯化得到分子质量110.8 ku、比活力为61.99 IU/mg的电泳纯β-木糖苷酶。酶学性质研究结果表明:该酶反应以温度60℃、pH值3.5为宜,在60℃以下、pH值3.0～8.0酶活性稳定,且该酶作用于对硝基苯基-β-D-木糖苷的Km值和Vmax值分别为0.29μmol/mL和169.99 IU/mg。酶水解机理研究结果表明,该酶从低聚木糖的非还原性末端切断β-1,4-糖苷键释放出木糖,其最适作用底物是短链的低聚木糖,随着低聚木糖碳链的增长,酶作用效率逐渐下降,而对木聚糖几乎不降解。

小麦内源性β-木糖苷酶活性测定条件的优化

以小麦粉为研究对象,探讨了反应温度、反应pH值和底物浓度对小麦内源性β-木糖苷酶(EC.3.2.1.37)活性的影响。在单因素实验的基础上,采用三因素三水平的正交方法,分析各个因素对β-木糖苷酶活性测定的影响,并对测定条件进行优化。所得最佳测定条件为:反应温度60℃、pH4.6、底物浓度14mmol/L。在此条件下,β-木糖苷酶活性为124.385U/kg。

小麦麸皮内源性β-木糖苷酶的酶学特性

以硝基苯酚-木糖苷为底物，在底物浓度为1 mg／ml ，提取液pH值为5的条件下，测定了小麦麸皮内源性β-木糖苷酶的酶活力，并对4种小麦麸皮内源性β-木糖苷酶的酶学特性进行了比较。结果表明：不同品种小麦麸皮内源性β-木糖苷酶的酶活力不同，同种小麦的粗麸皮和细麸皮中的内源性β-木糖苷酶的酶活力也不同；细麸皮中β-木糖苷酶的酶活力均高于粗麸皮中β-木糖苷酶酶活力，粗麸皮中郑麦8998的β-木糖苷酶酶活力最大，细麸皮中花培8号小麦β-木糖苷酶酶活力最大；郑麦8998、花培8号、郑麦366、郑麦90234种小麦粗麸皮内源性β-木糖苷酶的最适反应温度分别为60、50、50和60℃；最适反应pH值均为5；花培8号和郑麦366两种小麦粗麸皮内源性β-木糖苷酶在20～50℃范围内，酶活力稳定性较好，而郑麦8998和郑麦9023两种小麦粗麸皮内源性β-木糖苷酶在20～60℃范围内，温度对β-木糖苷酶的酶活力影响较小；4种小麦粗麸皮内源性β-木糖苷酶在pH值为5～6时，酶活力稳定性较好；Ca2＋、Co2＋促进β-木糖苷酶的酶活力，而Ag＋对β-木糖苷酶的酶活力有较强的抑制作用。

草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

草菇(Volvariellavolvacea)在20L发酵罐中以稻草粉为基质进行培养,所产生的β 木糖苷酶(β 1,4 xylosidase,EC3.2.1.37)经硫酸铵沉淀、苯基 琼脂糖(Phenyl agarose)疏水性柱层析、DEAE Sephacel阴离子柱层析、TOSOHASS HW 5S分子筛过滤分离等提纯步骤,达到了电泳纯,提纯倍数为241倍,收率为14.5%.该酶反应的最适pH值为6.41～6.76,最适温度为55℃;在pH值5.78～7.68之间酶活力相对稳定,52℃的半衰期(t1/2)为1h.由凝胶过滤和SDS PAGE测得酶由4个亚基组成,酶的相对分子质量为2825000.在所测定的底物中,β 木糖苷酶仅对对硝基苯基 β D 木糖苷有专一性水解作用,其对对硝基苯基 β D 木糖苷水解的动力学参数Km值为2.4mmol/L,vmax为42μmol/(min·mg).该酶催化对硝基苯基 β 木糖苷水解将产物β 木糖反转成α 木糖.

草菇β-木糖苷酶活性及其编码基因xyl的转录表达研究

本研究首先对草菇β-木糖苷酶编码序列Xyl进行了生物信息学分析,然后以对硝基木糖苷为底物测定了不同菌株中的木糖苷酶活性,并进一步比较了木糖苷酶基因xyl在草菇不同菌株中的相对表达量。结果表明:Xyl属于糖苷水解酶第43家族,由534个氨基酸残基组成,预测分子量为58.82ku,等电点为4.99;系统进化树分析表明,Xyl的氨基酸序列与木腐菌相似性较高,最高值达到61%,且草菇与木腐菌黄孢原毛平革、毛韧革菌等亲缘关系较近,但与同为草腐菌的灰盖鬼伞遗传距离较远;草菇不同菌株的β-木糖苷酶活性测定结果显示,Vb1的β-木糖苷酶活性最高,0229的β-木糖苷酶活性与A8之间无显著性差异;Real-time PCR结果显示,Vb1的xyl基因相对表达量也最高,三个菌株的xyl基因相对表达量依次为Vb1>A8>0229。

东方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究

东方肉座菌EU7-22具有高产半纤维素酶的能力。根据已报道的同属里氏木霉及绿色木霉木聚糖酶,木糖苷酶相关基因序列,设计PCR引物扩增出东方肉座菌内切木聚糖酶(XYNⅠ,XYNⅡ)及β-木糖苷酶(β-BXL)基因。序列经NCBIBlast分析:东方肉座菌xynⅠ基因与里氏木霉xyn1基因(X69573.1)的同源性最高达到91%;xynⅡ基因与绿色木霉xyn2基因(EF079061)同源性最高达到93%;β-bxl基因与里氏木霉β-bxl1基因(Z69257.1)的同源性最高达到94%。生物信息学分析表明内切木聚糖酶Ⅰ和Ⅱ均属于糖基水解酶家族11,N末端前19个氨基酸均为信号肽。内切木聚糖酶Ⅰ分子量为24.13kD,等电点为7.87,含有3个糖基化位点;内切木聚糖酶Ⅱ分子量为24.44kD,等电点为4.86,含有1个糖基化位点;β-木糖苷酶属于糖基水解酶家族3,分子量为87.27kD,等电点为5.49,N末端前20个氨基酸为信号肽,含有8个糖基化位点。利用SWISS-Model对木聚糖酶,木糖苷酶蛋白质三级结构进行了预测和模拟。对木聚糖酶和木糖苷酶基因及其编码蛋白质的生物信息学分析,为进一步研究这些基因的表达与调控、构建高效利用纤维素组份的工程菌株奠定基础。

伴侣蛋白提高木糖苷酶的可溶性表达及其协同酶解木聚糖

通过分子伴侣蛋白共表达的方式,对6种商业化的分子伴侣蛋白进行筛选以提高β-木糖苷酶(Xln-DT)的可溶性表达量。研究结果表明:构建诱导型质粒pG-KJE8和含有xln-DT基因的重组表达质粒pET-28a-xln-DT共表达系统后,Xln-DT的可溶性表达量为原酶初始表达量的1.31倍;以质量分数2.0%甘油为碳源,质量分数1.2%蛋白胨为氮源,添加0.01 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5μg/L四环素、1.5 g/L L-阿拉伯糖,32℃下诱导60 h,重组酶的表达量可达11.9 U/mL,较原酶提高了4.22倍。此外,利用内切木聚糖酶(XynB-DT)和Xln-DT协同酶解木聚糖,在添加Xln-DT后,榉木、桦木、玉米芯、燕麦和甘蔗渣5种木聚糖的酶解率分别为84.4%、90.2%、79.6%、77.3%和64.7%,相较于仅添加XynB-DT的酶解率有了显著的提高。

发芽处理对小麦面粉中内源性β-木糖苷酶的影响

为研究发芽对小麦面粉中β–木糖苷酶及阿拉伯木聚糖(AX)的影响,以发芽小麦的面粉(包括皮磨粉和心磨粉)为原料,测定发芽后β–木糖苷酶和AX的变化,研究面团的流变学特性,及其与面粉理化指标间的相关性。结果表明:小麦发芽的时间越长,β–木糖苷酶的活力呈先升高后降低的趋势;发芽小麦面粉中水溶性阿拉伯木聚糖(WE–AX)随发芽时间的延长含量逐渐升高,水不溶性阿拉伯木聚糖(WU–AX)含量降低,总AX呈现略微下降的趋势;发芽时间越长,面团的拉伸阻力越小,且皮磨粉低于心磨粉;发芽时间与β–木糖苷酶活性、WE–AX含量和延展性呈高度正相关,与总AX含量、WU–AX含量、灰分含量、拉伸阻力具有较好的负相关性;β–木糖苷酶活性与面团延展性高度正相关,与总AX、WU–AX、出粉率、拉伸阻力呈显著负相关(ρ<0.01)。

响应面法优化小麦麸皮内源性β–木糖苷酶提取条件

为提高小麦麸皮内源性β–木糖苷酶提取得率,该文采用响应面法对其提取条件进行优化,在单因素实验基础上,选择提取液pH、料液比、提取时间为自变量,以β–木糖苷酶的酶提取量为响应值,根据Box–Benhnken Design法设计响应面试验,进行显著性和交互作用分析,确定酶的最佳提取条件并进行验证,结果表明:提取液pH 4.93、料液比1∶9.85 g/mL、提取时间36.85 min为最佳提取条件,酶提取量为84.19 mU/g,与响应面拟合优化预测值非常接近。

利用pHsh载体克隆与表达双活性阿拉伯/木糖苷酶

将来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)的双活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)构建到新型热激质粒pHsh上,得到重组质粒。将重组质粒pHsh-xarB转入大肠杆菌(Escherichia coli JM109)。SDS-PAGE结果表明,该重组酶的分子量为86 kDa,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性好。

小麦系统粉中阿拉伯木聚糖与β–木糖苷酶研究

小麦系统粉因其出粉部位不同导致不同系统粉的各项指标具有一定的差异。该文研究了面粉中阿拉伯木聚糖(AX)、β–木糖苷酶的分布规律,及其与系统粉理化、质构指标之间的相关性。AX含量和β–木糖苷酶活性在小麦胚乳中的分布都是由内到外逐渐增加的,即1B<2B<3B,1M<2M<3M。在ρ<0.01水平上,AX与灰分为极显著相关,AX与水分、拉伸阻力显著相关;β–木糖苷酶与AX、灰分均呈显著性相关。

Aspergillus sp.1-13菌株β-木糖苷酶的提纯和部分性质

通过80 %饱和度硫酸铵沉淀、DEAE -SephadexA -50离子交换柱层析和SephadexG -100凝胶过滤柱层析等方法从Aspergillussp .1 -13菌株的白酒丢糟固体培养物的抽提液中分离纯化到一种 β-木糖苷酶。通过SDS -PAGE分析测定其分子量为110.9KD。该酶最适反应pH值为3.2～3.8之间,最适反应温度为70℃。该酶具有较宽的 pH稳定性 ,并且在60℃以下较稳定。