微生物来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的研究进展

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Alpha-L-arabinofuranosidase,α-L-AFase)属于糖苷水解酶类,主要功能是水解阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖取代基,并与其他水解酶协同促进半纤维素的降解,从而改善半纤维素的生物转化率。本文综述了近年来微生物来源α-L-AFase的酶学特性、性质改良、结构、催化机制和协同作用效应等方面的研究进展,发现不同微生物来源的α-L-AFase的理化性质、分子结构和催化机制均存在着多样性,重组表达的方法能有效改善α-L-AFase的活性和稳定性,且α-L-AFase与其他半纤维素水解酶的协同催化作用使底物的转化效率显著提高。α-L-AFase广泛应用于改善面团发酵质地、果汁澄清、酿酒工艺优化、制备高消化率饲料以及功能性保健产品研制等多个领域。本文为后续α-L-AFase的基础研究、开发和利用提供一定的参考。

车前子壳诱导木聚糖酶与阿拉伯糖苷酶协同制备

该研究以车前子壳为诱导底物,采用单因素试验和响应面试验对里氏木霉(Trichoderma reesei)诱导木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的协同制备条件进行优化。单因素试验结果表明,在诱导碳源为车前子壳,初始pH为5.0、底物质量浓度为20 g/L、培养时间为4.0 d、碳氮比为1.6∶1.0时,木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力最高,分别为(10.59±0.33)IU/mL和(8.99±0.05)IU/mL。响应面试验结果表明,最佳产酶条件为培养时间4.0 d、底物质量浓度20 g/L、碳氮比1.6∶1.0。在此最佳条件下,木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力分别为(11.42±0.15)IU/mL和(10.83±0.08)IU/mL,分别是未优化前的2.55倍和7.37倍。

蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性分析及转化人参皂苷Rg1与Rc应用

通过鉴定筛选得到1株高产β-葡萄糖苷酶的长白山虫草属真菌蛹虫草。研究碳源、氮源及pH值对菌株产β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、虫草酸与生物量的影响规律,从而获得高产生物活性物质的培养条件,并对蛹虫草转化人参皂苷Rg1与Rc的路径与转化率进行了研究。采用紫外检测法测定β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力,超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法鉴定转化产物中人参皂苷的组成,利用高效液相色谱法测定虫草素含量及人参皂苷的转化率。结果表明:蛹虫草在碳源为纤维二糖、氮源为牛肉膏、pH 8、培养120 h条件下有较高β-葡萄糖苷酶活力((74.70±0.09)U/mL)。在碳源为乳糖、氮源为蛋白胨、pH 4、培养72 h条件下有最高的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力((11.55±0.01)U/mL)。蛹虫草转化人参皂苷Rg1的路径为Rg1→Rh1和Rg1→F1,转化Rc路径为Rc→Rd→Rg3→CK和Rc→CMc。经过168 h的转化,人参皂苷Rg1转化率为54.9%,Rc转化率达到83.44%。本研究为提高药食两用真菌蛹虫草生物转化人参皂苷效率提供了理论基础,也为蛹虫草和人参食品、药品开发提供了一定理论支持。

极耐热性阿拉伯糖苷酶在木糖制备中的应用

阿拉伯糖苷酶作为木聚糖降解的限速酶之一,在植物残体的生物转化、食品加工、饲料工业以及纸浆漂白中具有广泛的应用潜力。实验中选择pET—28a作为表达载体,优化核糖体结合位点RBS与起始密码子ATG间距离,使来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热性阿拉伯糖苷酶得到高效表达,重组酶蛋白经一步热处理后纯度达到90%以上;木聚糖酶解试验结果表明,阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶间存在协同作用;阿拉伯糖苷酶与木聚糖酶和β-木糖苷酶联合水解木聚糖能明显提高酶解产物中木糖含量,因此,开发极耐热性阿拉伯糖苷酶在酶法制备木糖中的应用具有重要的经济效益和社会效益。

热稳定性α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的纯化

α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶对来源于被子植物的木聚糖类半纤维素的生物降解和转化是必不可少的。文中首次报道了国内对该酶的研究。α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因工程菌在发酵罐中以LB为基质进行生长 ,以乳糖为诱导剂 ,所产生的α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶在 70℃热处理 3 0min后、经DEAE Sephacel阴离子柱层析、金属Ni2 + 的亲和层析等提纯步骤 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 49 3倍 ,收率为 2 0 4%。SDS PAGE法测定α 阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的分子质量为 85ku 。

利用pHsh载体克隆与表达双活性阿拉伯/木糖苷酶

将来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)的双活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)构建到新型热激质粒pHsh上,得到重组质粒。将重组质粒pHsh-xarB转入大肠杆菌(Escherichia coli JM109)。SDS-PAGE结果表明,该重组酶的分子量为86 kDa,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性好。

小麦系统粉中阿拉伯木聚糖与β–木糖苷酶研究

小麦系统粉因其出粉部位不同导致不同系统粉的各项指标具有一定的差异。该文研究了面粉中阿拉伯木聚糖(AX)、β–木糖苷酶的分布规律,及其与系统粉理化、质构指标之间的相关性。AX含量和β–木糖苷酶活性在小麦胚乳中的分布都是由内到外逐渐增加的,即1B<2B<3B,1M<2M<3M。在ρ<0.01水平上,AX与灰分为极显著相关,AX与水分、拉伸阻力显著相关;β–木糖苷酶与AX、灰分均呈显著性相关。

低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543的基因克隆及性质研究

旨在获得在低温条件下具有高催化能力的低温木糖苷酶,并对其进行异源表达研究和酶学性质分析。利用Touch down PCR和TAIL PCR方法,从枝顶孢菌中克隆得到一个序列新颖的GH43家族双功能木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶基因ax543,该酶基因在毕赤酵母中成功表达。酶学性质分析发现重组酶AX543的最适温度为25℃,在15℃和4℃仍有54%和21%的相对酶活;具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶活性,并可以降解木二糖、木三糖、桦木木聚糖、榉木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖;可以与木聚糖酶Xyn11-1协同作用,协同度达1.46;具有高木糖/阿拉伯糖耐受性,抑制常数Ki分别为84.78 mmol/L和54.01 mmol/L。

连接肽对β-木糖苷酶HJ14GH43热适应性的影响

为揭示连接肽对β-木糖苷酶热适应性的影响机制,本文通过替换β-木糖苷酶HJ14GH43的连接肽序列获得突变子Mut LK10,利用大肠杆菌BL21(DE3)对其进行重组异源表达。表达后对Mut LK10纯酶进行酶学特性和蛋白质结构分析。结果表明:突变酶Mut LK10的最适温度为20℃,相比野生酶HJ14GH43降低5℃。突变酶Mut LK10在20℃和10℃下处理60 min后分别保持约28%和69%的相对酶活,而野生酶HJ14GH43在20℃和10℃下处理60 min后分别保持约70%和88%的相对酶活。突变酶的最适温度和热稳定性与野生酶相比均降低。野生酶和突变酶的连接肽是位于蛋白质表面的一段无规则卷曲区域。蛋白质结构分析表明:突变后该区域内的负电势面积增大,由此带来的是该区域内亲水性的增加。结论:增大连接肽中的酸性氨基酸比例,使β-木糖苷酶通过增加表面负电势面积来竞争水合作用,从而增加酶与溶剂的相互作用并最终使酶能适应低温环境。本研究结果可为β-木糖苷酶及其它类型酶的热适应性改性研究提供参考。

桃果实成熟软化过程中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性和乙烯合成相关因子的变化

以‘雨花三号’水蜜桃果实为试材,采用气相色谱法测定了桃果实成熟过程中乙烯释放量、氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶活性和ACC含量的变化,同时分析了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Afa)活性的变化。探讨了乙烯合成的相关因子和α-Afa对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,乙烯释放量、ACC氧化酶活性和ACC含量同时于成熟度Ⅳ出现高峰,α-Afa活性在成熟前期变化平缓,而在成熟中后期明显上升。本实验初步探明了α-Afa与乙烯的相互作用关系及其对桃果实成熟后期快速软化的作用机理。

阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性

阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶是木聚糖类半纤维素生物降解和转化所必需的酶类。本文在国内首次报道对该酶的研究 :通过PCR从产乙醇热厌氧杆菌ThermoanaerobacterethanolicusJW2 0 0克隆出编码高度热稳定性阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因 ,与组氨酸标签融合 ,以高拷贝质粒pAlter Ex1在大肠杆菌中得到高效表达 ;基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,得到的阿拉伯呋喃糖苷酶在pH4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,75℃的半衰期为 1h ;β 木糖苷酶在pH 5 .0～ 8.2之间有较高的稳定性 ,酶 1h半衰期温度为 84℃。

假密环菌cDNA文库的构建及其阿拉伯糖苷酶基因的克隆(英文)

用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的假密环菌的表达型cDNA文库。文库滴度为1.0×106pfu/ml,重组率约为98.3%,扩增后滴度为3.1×1 08pfu/ml,容量约为4.2×1010。从文库中随机挑选176个克隆进行5’端测序,得到147条表达序列标签(EST),并将测序结果提交到EMBL数据库。随机测序结果表明:插入片段长度均在200-800之间。测序结果经过生物信息学分析,发现有43 条序列与已知序列有明显同源性,其中序列AJ620046与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列有很高的序列一致性。用SMART-RACE技术成功获得了AJ620046的全长cDNA,克隆了AJ620046的开放阅读框AF,并成功构建了重组质粒pHIL-S1-AF,在毕赤酵母菌中进行了初步表达。

香蕉果实成熟软化时果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的变化(英文)

阿拉伯糖是果实软化过程中变化最明显的细胞壁糖残基之一,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是导致细胞壁多糖中阿拉伯糖残基降解的主要糖苷酶。为阐明该酶在香蕉果实成熟软化中的作用,实验对香蕉贮藏过程中果皮和果肉中该酶活性以及果实硬度、呼吸强度和乙烯释放量的变化进行了研究。结果表明:α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在果实初期的变化很小,到果实硬度开始急剧下降时达到最大,增加量达10倍以上,且果肉中的酶活性大于果皮中;乙烯吸收剂处理延缓了香蕉果实呼吸和乙烯高峰的出现时间,降低了果实硬度、果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性变化的速度和幅度。以上结果表明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶起诱导香蕉果实成熟的作用,在果实的软化中起着十分重要的作用,且其活性受乙烯的调节。

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌 (Thermotogamaritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因 ,以pET 2 0b为表达质粒 ,与其C末端 6个组氨酸标签序列融合 ,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为 90～ 95℃和pH 5 .0～ 5 .5 ,在pH 4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,95℃的半衰期为 4h ;SDS PAGE测得酶的分子量为 5 6 .5 7kD ,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中 ,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯 阿拉伯呋喃糖苷 (pNPAF)有专一性水解作用 ,其动力学参数Km 值为 0 18mmol L ,Vmax为 139μmol min·mg。

Bacillus pumilus阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及水解木聚糖的研究

从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.

重组阿拉伯糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达及其活性分析

假密环菌是一种果树腐病菌,具有较强的分解代谢纤维素的能力。根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列(Accession Number AJ620046)设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段,构建重组质粒pPIC9-AF,与组氨酸标签融合,电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活,最适反应活性pH值在 6．0～8．0之间,而在pH4．0～8．0范围内酶活基本保持在80％以上,比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了良好的基础。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在毕赤酵母中的表达及其对大麦麦芽过滤性能的影响

PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组扩增获得1个全长1 790 bp的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,基因含有1个50 bp的内含子序列,其对应的蛋白质序列含有5个O糖基化位点和9个N糖基化位点,N端含有18个氨基酸的信号肽序列。将目的基因与表达载体pPICZαA连接并在毕赤酵母X-33诱导表达,获得重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。重组酶的相对分子质量为70 kDa,最适反应pH和温度分别为pH 5.5和50℃;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)和Fe^(2+)对重组酶的酶活有抑制作用,Fe^(3+)对重组酶的酶活有促进作用;以4-Nitrophenylα-L-arabinofuranoside为底物测得酶的Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57μmol/(min·mg)。在大麦麦芽协定糖化的初始阶段添加31.2 mU/g重组酶,麦汁的过滤速度提高了12.8%。以大麦麦芽阿拉伯木聚糖为底物,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶有较好的协同作用。

阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及其发酵工艺优化

将来源于草酸青霉菌(Penicillium oxalicum sp.68)的阿拉伯呋喃糖苷酶基因poabf62a进行密码子优化后,在毕赤酵母GS115中重组表达PoAbf62A酶,并分析酶学性质。为进一步提高重组蛋白表达量,通过单因素及响应面分析法优化了重组菌株产PoAbf62A酶的发酵工艺。结果表明,以对硝基苯-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(p-nitrobenzene-L-arabinofuranoside,p NPAF)为底物时,重组阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A的最适反应pH值为4.5,最适反应温度为40℃;该酶在pH 4.5和40~45℃下较稳定;Al 3+、Co 2+、Zn 2+、Mg 2+等金属离子对该酶活性有促进作用,Fe 3+、Mn 2、Cu 2+和Fe 2+可抑制其活性;以p NPAF为底物测得酶的K m值为2.46 mmol/L,最大反应速度V max为9.05μmol/(min·g),k cat为0.22 s-1。最佳发酵参数为:BMMY培养基中接种量初始OD 600值为2.4,添加诱导剂甲醇的体积分数为1.05%,每24 h补加甲醇使甲醇的体积分数恒定,30.5℃发酵120 h,发酵液酶活力为0.51 U/mL,相比未优化前提高了3.25倍。

一个来源于稻平脐蠕孢的α-阿拉伯呋喃糖苷酶

旨在获得能降解玉米糠木聚糖的阿拉伯呋喃糖苷酶,并对其进行异源表达和酶学性质分析。稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)是重要的植物病原菌,它编码、分泌糖苷水解酶降解植物的木质纤维素利于侵袭感染。从稻平脐蠕孢中克隆得到一个新的GH43家族阿拉伯呋喃糖苷酶基因BoAra43A并将其在大肠杆菌中成功表达。分析发现重组酶BoAra43A的最适温度为50℃,在40℃处理2 h后活力还剩90.6%活性;最适pH为5.0,在pH 3.0-9.0比较稳定,可保持80%以上的酶活力。BoAra43A可降解富含侧链的异质性木聚糖如小麦阿拉伯木聚糖(WAX)、玉米糠(CX)及其碱提物(CX-NaOH)和寡糖如A2,3XX、XA2,3XX、AA2,3AA/AAA3A中的阿拉伯糖,推断其能降解阿拉伯糖双取代的木聚糖中α-(1→3)连接的阿拉伯糖。PsAra43A是来源于Paenibacillus sp.E18的GH43阿拉伯呋喃糖苷酶,降解异质性木聚糖上的单取代阿拉伯糖侧链。使用BoAra43A预先处理CX、再和阿拉伯呋喃糖苷酶PsAra43A反应,两种酶之间具有较强的协同作用,协同度为1.34。