基于游离质粒的木糖诱导型枯草芽孢杆菌转化体系的建立及其应用

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为食品级安全菌株,因其具有理化特征清晰、培养发酵方便等特点,广泛应用于异源蛋白质的高效表达以及高附加值物质的合成。传统的B.subtilis遗传转化方法存在操作流程繁琐、效率低等缺点,因此,开发方便高效的遗传转化系统具有重要意义。转录因子ComK被证实能调控B.subtilis感受态的形成,并在B.subtilis高效转化中有重要作用。构建1个含有木糖诱导启动子P_(xyl)调控comK表达的穿梭质粒pUBC01⁃P_(xyl)⁃comK的菌株B.subtilis K1,经木糖诱导条件优化后,质粒pHY300⁃p43⁃egfp的转化效率达到4.8×10^(3) CFU·μg^(-1)。此外,质粒pUBC01⁃P_(xyl)⁃comK可在无胁迫条件下连续培养及消除。木糖诱导感受态体系及质粒消除极大地提高了芽孢杆菌基因编辑和菌株改造的便捷性,同时增强了菌株尤其是生产菌株的性状稳定性。

木糖和葡萄糖共发酵生产L-组氨酸

以1株L-组氨酸生产菌Escherichia coli HIS1为研究对象,优化其L-组氨酸合成关键酶His G*的诱导条件。通过摇瓶发酵的方式确定诱导剂木糖的最适质量浓度为10 g/L;通过5 L发酵罐发酵的方式确定最佳诱导时间为发酵8 h时诱导;因发酵过程中木糖会被消耗,故通过多次添加木糖或敲除xyl A基因阻断木糖代谢途径保持发酵液中的木糖浓度,以稳定诱导条件。结果表明,木糖同时作为诱导剂和碳源更有利于L-组氨酸的发酵生产,为此摸索出了木糖和葡萄糖共发酵生产L-组氨酸的发酵工艺。该工艺主要控制要点为发酵8 h之后添加质量浓度为10 g/L的木糖,发酵过程中流加木糖和葡萄糖质量比为1∶5的糖溶液。最终L-组氨酸的产量可达56.5 g/L,是纯葡萄糖发酵时的2倍。

嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达

为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了初步发酵优化。结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间、诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶活力可达(168. 2±9. 41) U/m L。最佳的发酵条件为,在24 h添加诱导剂,诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停止发酵。该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考。

细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达

【目的】实现地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达,并研究该重组酶的酶学性质。【方法】克隆巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白,构建一个大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达质粒,使用该诱导型启动子介导麦芽糖淀粉酶编码基因,实现其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。对重组枯草芽孢杆菌的诱导条件进行优化,提高麦芽糖淀粉酶的产量。【结果】获得了诱导表达麦芽糖淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。最适诱导温度为45°C,最适诱导剂添加浓度为1%,最适添加诱导剂时间为接种培养9 h后。重组酶蛋白分子量大小为67 k D,对该酶的酶学性质研究发现,以可溶性淀粉为底物,反应生成麦芽糖和葡萄糖,其中麦芽糖含量为60.42%。重组酶最适作用温度为45°C,最适作用p H为6.5,Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统可以实现麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导型表达,酶活最高可达296.64 U/m L发酵液,在工业上有着较好的应用前景。

巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中诱导表达及碳代谢去阻遏

【背景】β-淀粉酶在食品和医疗领域应用广泛。目前工业上使用的β-淀粉酶主要从植物中提取,生产成本高,限制了β-淀粉酶的应用。微生物生产的β-淀粉酶尽管早有报道,但由于产酶水平低下,因而一直未能实现工业化。【目的】实现巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导表达,缓解碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression,CCR)对该重组酶表达的影响,并研究其酶学性质。【方法】克隆枯草芽孢杆菌木糖诱导启动子,构建木糖诱导表达载体以介导巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶编码基因amyM在枯草芽孢杆菌中的异源表达。定点突变位于amyM信号肽编码区的分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element,CRE),降低碳源代谢对重组β-淀粉酶施加的阻遏。【结果】构建了诱导表达β-淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。同义替换amyM-CRE保守碱基在不同程度上缓解了碳源所施加的CCR效应,重组酶的表达水平得到显著提高。重组酶的分子量为57 kD,水解可溶性淀粉主要生成麦芽糖和少量葡萄糖,其中麦芽糖含量为72%。该酶最适作用温度为50°C,最适反应pH为6.0。Co2+、Ca2+对重组β-淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统和碳代谢去阻遏实现了β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,酶活最高可达97.16 U/mL发酵液,比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶产量提高了440倍,为β-淀粉酶发酵生产的工业化提供了支撑。