Pichia stipitis木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2.将该基因连入酵母表达载体pYX212的强启动子磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子下,得到融合表达载体pYX-XYL2.通过电转化方法将pYX-XYL2转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A中,酶活测定表明在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2得到活性表达,酿酒酵母转化子粗酶液中木糖醇脱氢酶比活为每毫克蛋白0.6 U左右,约为供体菌的2.4倍.与基因供体菌不同,木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导,为组成型表达.

休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)木糖醇脱氢酶基因(xyl2)克隆与序列分析

根据木糖醇脱氢酶基因序列相似的特点,根据树干毕赤酵母(Pichia.stipitis),热带假丝酵母(Candida tropicalis)设计1对简并引物获得C.shehatae HDYXHT-01木糖醇脱氢酶基因的序列,此片段长为1095bp。利用生物信息学软件对此序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、CDS分析、二级结构预测。结果表明,该克隆片段为C.shehatae HDYXHT-01木糖醇脱氢酶基因的序列。

木糖醇脱氢酶研究进展

综述了木糖醇脱氢酶研究现状,包括木糖醇脱氢酶的提取、结构、理化性质以及辅酶改造,同时对利用生物技术进行木糖醇脱氢酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。

代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母的构建

为使酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58代谢木糖产乙醇,采用PCR方法克隆得到树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖醇脱氢酶基因xyl2,并将该基因和克隆得到的休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)缺终止子的木糖还原酶基因xyt1一起连接到酵母表达载体pYES2的强启动子GAL下,得到融合表达载体pYES2-P12。通过醋酸锂转化的方法将pY- ES2-P12转入S．cerevisiae YS58中,得到S.cerevisiae YS58—12。利用所构建的重组酿酒酵母进行木糖发酵实验,结果表明该重组酵母能发酵木糖,使木糖利用率得到进一步提高,最高达到81．3％,而且能代谢木糖产生乙醇。

代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母的构建

采用RT-PCR的方法克隆得到Candida shehatae木糖还原酶基因xyl1,将该基因插入到含有强启动子ADH1的穿梭质粒pACT2中,用同样的方法克隆得到Pichia stipitis的木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因插入到含有强启动子PMA1的穿梭质粒pDR195中,两套外源基因连同各自的启动子和终止子将连接到酵母整合质粒YIp5-kanR中,并预期整合到酿酒酵母的基因组当中,从而构建代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母。

代谢木糖重组酿酒酵母的初步构建

为使酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢木糖产乙醇,须要在酿酒酵母胞内表达木糖代谢途径的关键酶基因——木糖还原酶基因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2,这2种酶基因的相对表达水平对乙醇的产生和木糖醇的积累具有重要影响。该研究初步构建了含有诱导型启动子控制的木糖还原酶基因xyl1的酵母表达载体pYes2-xyl1和含有组成型强启动子控制的木糖醇脱氢酶基因xyl2的酵母表达载体pDR195-xyl2,同时,在国内首次克隆出热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因。这2个表达载体的构建为后续重组酵母的构建提供了重要基础。