链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达

从橄榄绿链霉菌StreptomycesolivaceoviridisA1中克隆出木聚糖酶基因xynA ,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET 2 2b(+)上的pellB信号肽编码序列之后 ,得到 2种构建的重组载体 ,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达 ,表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中 ,转化毕赤酵母得到重组子 ,在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达 ,在摇床培养水平上的表达量达到 2 0 0mg L ,且表达产物具有生物学活性。

木聚糖酶基因研究进展

半纤维素分解微生物在自然界碳素循环中起着重要作用,半纤维素是植物多糖的重要成分之一。木聚糖则是半纤维素的主要成分。木聚糖酶(EC3.2.1.8)可催化木聚糖的水解,在各种各样的生物体里都发现有木聚糖酶,如细菌、放线菌、真菌。在过去几十年里,有超过100个木聚糖酶基因被克隆进同源或异源宿主中,其目的是为了超表达木聚糖酶和改变它们的特性以适应商业应用。木聚糖酶的应用极其广泛,可用于生物转化、造纸、食品、饲料、能源、纺织等行业。尤其是迫切的环境问题将进一步促进木聚糖酶研究的开展。

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。

堆肥未培养细菌的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆和鉴定

从自制堆肥样品中提取未培养细菌的总DNA,用柯斯质粒pW EB∷TNC为载体构建宏基因组文库,对文库进行筛选获得表达木聚糖酶活性的克隆,再进行亚克隆、测序分析以及B lastx搜索G enB ank分析木聚糖酶基因。结果构建得到一个包含约5万个克隆的宏基因组文库,文库中外源DNA总容量约为1.8×106kb,获得2个表达木聚糖酶活性的克隆:pGXN 1050和pGXN 1051,鉴定分析表明:pGXN 1050上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11A具1个771bp的ORF(Open R ead ing F ram e),可编码含257个氨基酸的蛋白质,所编码产物与混合纤维弧菌(C ellv ibr io m ix tus)的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有46%的一致性和57%的相似性;pGXN 1051上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11B具一个723bp的ORF,可编码含241个氨基酸的蛋白质,编码产物与混合纤维弧菌的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有73%的一致性和80%的相似性。木聚糖酶Um xyn11A和Um xyn11B都属于糖基水解酶家族11的成员。

极端耐热木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达

目的:为了在枯草芽孢杆菌中整合表达极端耐热木聚糖酶。方法:将嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)Rt46B.1的极端耐热木聚糖酶基因xynB通过穿梭载体pDL整合到B.subtilis168染色体上,使其实现表达。结果:极端耐热木聚糖基因在枯草芽孢杆菌中成功整合并表达。结论:基因工程菌B.subtilis168-xynB能外泌表达极端耐热木聚糖酶,且表达水平为0.732IU/mL,比在大肠杆菌中的高。酶学性质表明,此酶分子量约为24kD,其最适反应温度为85℃,最适反应pH值为6.5,且在弱碱性条件下稳定。

一种新型木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

为了获得新型木聚糖酶的高效分泌表达,在工程酶项目组前期原核表达了木聚糖酶基因xyn A的基础上,将xyn A基因(Gen Bank登录号:U57819)编码耐热性木聚糖酶成熟蛋白的部分序列克隆到p PICZαA表达载体上,转化毕赤酵母X33,成功构建真核表达体系,再分批加入0. 5%(V/V)甲醇诱导毕赤酵母工程菌株产胞外木聚糖酶。结合木聚糖酶活力检测、SDS-PAGE电泳和Western Blot分析胞外木聚糖酶表达情况。结果表明,该XynA含有典型的糖苷水解酶11类催化结构域(GH11),成熟蛋白的预测分子量为38. 6 ku,等电点为6. 86; 7个毕赤酵母基因工程菌株X33/p PICZαA-xyn A分泌的木聚糖酶活力均≥300 U/m L,最高达487. 2 U/m L;胞外木聚糖酶在SDS-PAGE和Western Blot检测的特征谱带分子量约为45 ku,均比预期分子量(38. 6 ku)略大。一种新型木聚糖酶获得了高效分泌表达,为进一步分离纯化,研究其性质、结构和功能奠定了基础。

枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因的表达

构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体并用菌体自身信号肽引导表达外源木聚糖酶基因,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统的建立奠定基础。利用基因工程的原理和方法,将壮观霉素抗性基因(spec)与短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因(xynA)克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体GJ148上,构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到已构建载体上,以枯草芽孢杆菌WB700为表达宿主,引导木聚糖酶基因进行表达。最终成功构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到pYG上,在WB700中引导并表达木聚糖酶基因。试验证明信号肽筛选载体可以成功构建,在克隆入信号肽后可成功表达木聚糖酶基因,为信号肽的系统性筛选和木聚糖酶高效表达提供依据。

BACILLUSSP.BT7木聚糖酶基因的克隆与鉴定

报道了从一株有较高半纤维素酶活性的Ｂａｃｉｌｕｓｓｐ．ＢＴ７克隆内切木聚糖酶基因的结果．以大肠杆菌ＸＬ１ｂｌｕｅ为宿主菌，采用水解圈检测法，在含有ＲＢＢ木聚糖（４氧甲基Ｄ葡萄糖苷Ｄ木聚糖Ｒｅｍａｚｏｌ亮蓝Ｒ）的平板上分离到能水解ＲＢＢ木聚糖的阳性克隆３个，对它们进行的限制酶作图和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明。

不同日粮类型对绵羊瘤胃微生物木聚糖酶基因多样性的影响

选取安装有永久性瘤胃瘘管的中国美利奴绵羊4只,先后饲喂全粗料日粮和精料型日粮(精粗比3∶2),提取微生物宏基因组DNA。通过PCR产物克隆文库构建、DNA测序和序列分析以研究在不同日粮条件下,绵羊瘤胃微生物糖苷水解酶第10家族(GH10)和第11家族(GH11)木聚糖酶基因的多样性。结果表明,全粗料日粮时分别获得108和137条GH10和GH11家族木聚糖酶基因片段,精料型时分别获得145和235条GH10和GH11家族木聚糖酶基因片段,这些序列分别归属于19、20、53和26个操作分类单元(OUT)。DNA序列分析表明,GH10家族木聚糖酶基因片段与梭菌和拟杆菌来源的木聚糖酶基因有较高的相似性,GH11家族木聚糖酶基因片段与放线菌、麦角真菌来源的木聚糖酶基因有较高的相似性。饲喂全粗料日粮时,有57.9%的GH10家族序列与已知木聚糖酶基因的相似性小于90%;饲喂精料型日粮时,有65.4%的GH11家族序列与已知木聚糖酶基因的相似性小于90%。由此可见,绵羊瘤胃微生物GH10和GH11家族木聚糖酶基因序列具有丰富的多样性,并且大部分为新发现的序列。饲喂全粗料日粮时,更有利于发现瘤胃微生物GH10家族木聚糖酶新序列;饲喂精料型日粮时,更有利于发现GH11家族木聚糖酶新序列。

乳糖诱导极耐高温木聚糖酶基因B在大肠杆菌中的表达

以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,IPTG诱导时酶活力达到16 18U/ 10 0mL。乳糖诱导的最优发酵条件为:初始培养基pH 7 0 ,当OD60 0 为2 5时加入0 5 %的乳糖,在37℃条件下诱导培养10h ,收获时OD60 0 达3 5 5 ,酶活力为2 5 91U/ 10 0mL。

瘤胃枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其木聚糖酶基因的克隆和在乳酸球菌中表达的研究

通过形态学和16S rDNA序列分析方法,从绵羊瘤胃内容物中分离得到的细菌中鉴定出枯草芽胞杆菌。根据GenBank中已知Bacillus subtilis木聚糖酶基因序列设计带有酶切位点的引物,克隆到2条不同的木聚糖基因序列。通过酶切和连接等相关分子方法成功构建出以pMG36e为载体的表达木聚糖酶的重组质粒,转化到乳酸球菌粒MG1363后,均能高效表达,酶活性分别为28.29 U/mL和7.11 U/mL,比原枯草芽胞杆菌酶活2.17 U/mL高出13.04倍和3.28倍。

木聚糖酶基因的分子生物学与基因工程

木聚糖是由β-D-1,4木糖苷键连接起来的并带有多种取代基的多聚糖,约占植物干重的20%～30%左右,是一种巨大的生物资源。降解木聚糖的酶主要为木聚糖酶,该酶不仅在降解自然界大量存在的木聚糖起重要作用,同时它还具有潜在应用前景,如在饲料工业中可大幅度提高半纤维素类饲料的消化利用率等,因而引起了人们的极大兴趣。本文综述了木聚糖酶的分子生物学及其基因工程研究的最新进展,并展望了其在饲料工业中的研究前景。

木聚糖酶基因umxyn10B的克隆与表达研究

从富集培养物宏基因组文库中筛选获得1个表达木聚糖酶活性的克隆pXYN12。鉴定分析表明:pXYN12上潜在的木聚糖酶基因umxyn10B大小为999 bp,编码产物与嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophi-lus)的木聚糖酶基因(GenBank索引号AAZ74783)的氨基酸序列有63%的一致性和76%的相似性,属于糖基水解酶家族10的成员。PCR扩增了umxyn10B的含催化功能域编码区的DNA序列并连接到表达载体pET-30a(+)上,构建成表达质粒在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中实现了表达,并对表达条件进行研究。

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB0 30的内切 1,4 木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上 ,得到重组质粒pH BM2 2 0 ,将pHBM2 2 0经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD116 8,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM2 2 0 )、GS115 (pHBM2 2 0 )、SMD116 8(pHBM2 2 0 )分别诱导产酶 ,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明 ,三者的最适反应pH值约为 5 5 ,最适反应温度约为 6 0℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为 10 80IU mL ,11 6 3IU mL ,9 6 8IU mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM2 2 0 )所产酶的热稳定性较好 ,而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。

木聚糖酶基因的体外定向进化

木聚糖酶在天然材料中基因表达水平低、活性差、生产成本高,严重限制了它的推广应用。宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在开发微生物酶资源上具有强劲的优势。体外定向进化技术模拟达尔文的自然进化论,利用基因的突变和重组,从体外改造酶基因,产生基因多样性,并结合定向的筛选最终获得预期性状的进化酶。宏基因组技术与体外定向进化技术结合必将加速木聚糖酶的开发和产业化应用,推动半纤维类生物能源的利用。为此,本文就木聚糖酶基因的来源、宏基因组学在木聚糖酶基因开发中的应用、体外定向进化进行了系统的综述。

木聚糖酶基因xyn I的克隆和序列分析

以宇佐美曲霉E001总RNA为模板,采用RT-PCR等技术扩增了木聚糖酶基因(xynI)的cDNA全序列(GenBank登录号DQ302412)。该cDNA全长881 bp,其中5′和3′端非编码区分别为97和106 bp,信号肽编码区111 bp,成熟肽编码区567 bp编码188个氨基酸组成的木聚糖酶Xyn I。以E001基因组DNA为模板,采用单侧PCR等技术扩增了xynI的DNA全序列(GenBank登录号DQ302413)。该DNA全长1 098 bp,含启动子序列、内含子和外显子等核苷酸序列。将xynI cDNA所推导的Xyn I一级结构与GenBank中报道的其它相关序列进行了同源性比较。结果表明,E001 Xyn I是一种新的木聚糖酶,且具有第G/11家族木聚糖酶的共同特征。

4种芽孢杆菌来源木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶活分析

研究旨在比较4种不同来源木聚糖酶基因在大肠杆菌E.coli BL21中表达后的酶活等性质，为生产中筛选高表达量及耐极性木聚糖酶基因提供依据、根据已发表的木聚糖酶基因序列设计引物，分别扩增出浸麻芽孢杆菌（B．nlaeerans）B3、地衣芽孢杆菌（B．1ichenitormis）B6、蜡样芽孢杆菌（B．cereus）B10和枯草芽孢杆菌（B．subtilis）B12的木聚糖酶基因片段，经克隆表达后获得4种工程茼经培养和IPTG诱导后进行SDS—PAGE电泳检测及酶特性分析、测序结果表明，4个基因的开放阅读框均为642bp。其中前3种木聚糖酶基因均为首次报道、4种重组木聚糖酶在55℃下的酶活分别为：36．16、3．85、7．22、98．98U／ml、、4种重组木聚糖酶的最适反应温度均在50～60℃，且枯草芽孢杆菌木聚糖酶最为耐热，、结果提示，枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶具有较高的酶活和较好的耐热性。

果胶裂解酶基因与木聚糖酶基因的共表达

利用重叠引物PCR方法将从海栖热袍杆菌中克隆得到的果胶裂解酶基因和从桔青霉CR-2菌株中克隆得到的木聚糖酶基因做重叠引物PCR扩增,扩增后得到融合基因plyxyl,将其构建载体后转化到大肠杆菌菌株BL21,克隆子经IPTG诱导在原核系统中实现了表达,p H值为中性,诱导6 h后最高酶活性分别达30.11 U/m L、2.03 IU/m L。

4种芽孢杆菌来源木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶活分析

研究旨在比较4种不同来源木聚糖酶基因在大肠杆菌E．coliBL21中表达后的酶活等性质，为生产中筛选高表达量及耐极性木聚糖酶基因提供依据。

木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达

参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA,插入pET-20b载体,获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16℃下诱导效果最好,10 h酶活达到42.05 U/mL,重组酶占全细胞蛋白的47%,粗酶在65℃和pH 5～8条件下很稳定。