黑曲霉木聚糖酶GH10 Xyn4配伍新丽鞭毛菌GH11 Xyn1B降解木聚糖的协同作用

为提高木聚糖的酶解效果,试验在筛选出最佳产木糖效率的GH11家族木聚糖酶Xyn1B基础上,分析瘤胃真菌新丽鞭毛菌来源GH11木聚糖酶Xyn1B和黑曲霉源GH10家族木聚糖酶Xyn4的酶解特性,探究木聚糖酶GH11 Xyn1B和木聚糖酶GH10 Xyn4配伍使用对糖产量及产物中寡糖组成的影响。试验中使用的GH10 Xyn4和GH11 Xyn1B单一木聚糖酶及其不同配伍混合木聚糖酶溶液的酶活力浓度均为0.879 IU/mL,然后测定木聚糖酶的种类、添加量以及GH10 Xyn4和GH11 Xyn1B木聚糖酶不同配伍比例对木聚糖酶解效果的影响。结果表明,在哈茨木霉GH11敏感木聚糖酶XynHar、瘤胃真菌新丽鞭毛菌GH11抗性木聚糖酶Q9U、瘤胃真菌新丽鞭毛菌GH11抗性木聚糖酶Xyn1B中,抗性木聚糖酶GH11 Xyn1B的催化效率最高,所得酶解产物的OD值最高;GH11 Xyn1B在酶用量为400μL时产糖量接近峰值;GH11木聚糖酶Xyn1B和GH10木聚糖酶Xyn4的复配酶液催化产糖量均高于单独酶液,反应时间2 h时、GH11 Xyn1B:GH10 Xyn4为5:5时产糖量可以达到最高,酶解产物中包含较高含量的木二糖、木三糖以及其他木寡糖。

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。

宇佐美曲霉木聚糖酶的纯化和性质

采用缓冲液浸提、硫酸铵盐析、Phenyl-Sepharose CL-4B疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等分离纯化手段,从宇佐美曲霉E001固态发酵曲中分离出木聚糖酶组分,再经DE-AE-Sepharose fast flow阴离子交换层析进一步纯化,获得了两种电泳纯木聚糖酶XynⅠ和XynⅡ.分别采用SDS-PAGEG-75凝胶过滤层析测得XynⅠ、XynⅡ相对分子质量,两种酶均为单体蛋白质;等电聚焦电泳测得两种酶的等电点(pI);测定了XynⅠ、XynⅡ的酶动力学常数;序列测定XynⅡN末端15个氨基酸残基的.

木聚糖酶基因xyn I的克隆和序列分析

以宇佐美曲霉E001总RNA为模板,采用RT-PCR等技术扩增了木聚糖酶基因(xynI)的cDNA全序列(GenBank登录号DQ302412)。该cDNA全长881 bp,其中5′和3′端非编码区分别为97和106 bp,信号肽编码区111 bp,成熟肽编码区567 bp编码188个氨基酸组成的木聚糖酶Xyn I。以E001基因组DNA为模板,采用单侧PCR等技术扩增了xynI的DNA全序列(GenBank登录号DQ302413)。该DNA全长1 098 bp,含启动子序列、内含子和外显子等核苷酸序列。将xynI cDNA所推导的Xyn I一级结构与GenBank中报道的其它相关序列进行了同源性比较。结果表明,E001 Xyn I是一种新的木聚糖酶,且具有第G/11家族木聚糖酶的共同特征。

宇佐美曲霉E001菌株XynⅡ基因的克隆和融合表达

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001株基因组DNA为模板,PCR扩增了编码木聚糖酶Ⅱ(Xyla-nases,XynⅡ)成熟肽的DNA片段。构建重组克隆质粒pUCm-T-XynⅡ,并以其为摸板,PCR扩增XynⅡ成熟肽的cDNA片段(555 bp),连接于表达质粒pGEX-5X-3的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间,构建重组表达质粒pGEX-5X-3-XynⅡ,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行检测。结果表明,XynⅡDNA中存在1个内含子,长度为51 bp;融合蛋白GST-XynⅡ主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为50 ku,IPTG诱导1,3和5 h融合蛋白GST-XynⅡ的表达量分别约占菌体总蛋白量的12.6%,25.3%和32.1%。表明宇佐美曲霉E001菌株XynⅡ基因融合表达成功。