PagKNAT2/6a与PagKNAT2/6b在木质部发育中存在功能保守性

[目的]通过比较分析PagKNAT2/6a与PagKNAT2/6b在木质部发育中的功能差异,解析KNOX基因在木材形成过程中的生物学功能。[方法]利用相关软件进行基因序列比对分析;通过对转基因植株进行GUS染色和实时荧光定量(qRT-PCR)等实验进行基因表达模式分析,随后对茎部解剖学分析,进而解析PagKNAT2/6a对木质部发育的影响;最后,对次生壁合成相关基因(如纤维素合成相关基因CESA4、CESA7A、CESA7B等;半纤维素合成相关基因GUX1a、GUX1b、PARVUS;木质素合成相关基因COMT、CAD、LAC4等)的表达分析探究PagKNAT2/6a对次生壁合成的调控机制。[结果]PagKNAT2/6a与PagKNAT2/6b序列高度相似,在‘84K’不同组织中均有表达,在杨树茎、茎尖以及幼嫩叶片中表现出较高的表达量。对PagKNAT2/6a转基因植株的茎部解剖分析表明,与野生型相比,PagKNAT2/6a过表达抑制木质部发育;同时qRT-PCR分析表明PagKNAT2/6a基因通过调控次生壁合成相关基因的表达影响木质部发育。[结论]PagKNAT2/6a与PagKNAT2/6b均负调控木质部发育,同时存在功能保守性。

赤霉素调控木质部发育的细胞学研究

以烟草为材料,通过转基因技术与外源施用激素,获得了超表达PtGA20ox、PtGA2ox1及NtGA20ox RNAi转基因植株及不同激素处理野生型烟草植株,并对这些植株茎部木质部进行了石蜡切片及显微观察。结果表明:提高内源赤霉素(GA)水平或外源施用GA3能够明显促进烟草节间快速伸长,并促使木质部形成提前,木质部分化程度提高;降低内源GA水平或外源施用GA合成抑制剂PAC则延缓木质部的发育。研究结果证明了GA在木质部发育过程中起到正向调控作用,且存在依赖GA浓度的调控机制;生长素IAA对木质部发育的正向调控作用至少部分是通过促进GA的合成实现的。

毛果杨PtrMYB161基因在木质部发育中的表达调控

木材形成是一个复杂的发育过程包括维管形成层分化形成次生木质部以及木质部中细胞壁的加厚等,其中MYB家族转录因子在此过程中发挥着重要调控作用。通过RNA-seq对毛果杨(Populus trichocarpa)基因组中的MYB基因表达模式分析,结果发现PtrMYB161基因在木质部特异表达,并且主要在纤维细胞中特异表达。为解析该基因在木质部发育中的表达调控功能,构建35S::PtrMYB161植物表达载体并进行毛果杨遗传转化,共获得6个PtrMYB161过表达转基因株系。RT-PCR结果表明,在过表达转基因株系中PtrMYB161基因的表达丰度增加500~5 000倍。表型和组织形态学分析表明,表达丰度增加最多的L5株系表现出明显的植株矮小、叶片面积小、茎节短、茎直径小、木质部面积减小及纤维细胞数量降低等特征,表明PtrMYB161基因参与调控毛果杨木质部发育等过程并起着至关重要的作用。

白桦BpNAC012基因调控白桦木质部发育表达谱分析

NAC转录因子成员被认为是调控植物次生壁合成的开关。前期研究结果显示BpNAC012基因的表达能够调控白桦次生细胞壁的合成。为研究BpNAC012调控的下游靶基因,本研究分别以该基因的过表达,抑制表达株系茎为材料构建转录组,以野生型为对照分析差异表达基因。结果显示:与对照相比,过表达株系OE中上调的基因有627条,下调的基因有229条,抑制表达株系中上调的基因有299条,下调表达的基因有207条。过表达BpNAC012相对于抑制表达能够调控更多的基因表达变化。而抑制表达BpNAC012更多的是影响蛋白修饰和转运类基因的表达变化。在差异表达基因中,涉及受体信号通路,营养代谢,氨基酸合成,及苯丙烷生物合成相关代谢通路基因比较富集。BpNAC012能够调控纤维素、木质素合成及木质部发育相关基因的表达变化,同时能够调控多种转录因子的表达变化。该研究为深入分析BpNAC012在白桦次生细胞壁合成的分子调控机制奠定基础。

银腺杨生长素受体基因PagFBL3对茎生长发育的影响

【目的】本研究分析了银腺杨生长素受体基因PagFBL3的序列结构、组织表达特异性和亚细胞定位,并创制了过表达PagFBL3转基因杨树,探讨其对茎次生生长的影响,为进一步阐明生长素受体在茎次生生长中的作用机制提供帮助。【方法】利用生物信息学方法及相关软件分析系统进化关系、序列相似性及生化特征;克隆并鉴定了银腺杨PagFBL3基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析该基因在根、幼叶、成熟叶、幼茎、维管形成层、木质部和韧皮部中的表达;利用Gateway技术,构建融合表达载体35S::PagFBL3-GFP,通过瞬时转化烟草叶片表皮分析PagFBL3的亚细胞定位;同时,将PagFBL3编码区序列重组进入pMDC32载体,构建植物过表达载体35S::PagFBL3,利用农杆菌介导法创制转基因银腺杨,通过表型观察和组织切片分析过表达PagFBL3基因对转基因杨树茎部生长发育的影响。【结果】PagFBL3基因可编码571个氨基酸残基,其编码蛋白定位于细胞核。PagFBL3基因在根、茎和叶中均有表达,并在成熟叶和次生茎中表达量较高。基于抗性筛选和分子水平鉴定,创制了11个过表达PagFBL3转基因杨树株系,选择两个表达量较高的转基因株系进行功能分析。与非转基因植株相比,过量表达PagFBL3基因促进转基因杨树木质部发育,显著增加了转基因杨树的木质部宽度,提高了转基因杨树的径向生长,地径分别增加6.7%和8.5%,第15节间木质部宽度分别增加17.3%和19.9%。此外,过量表达PagFBL3基因也增强了植株的高生长,株高分别增加6.3%和6.9%。【结论】PagFBL3基因主要在成熟叶和次生茎中表达并发挥作用,通过影响木质部发育,提高木质部宽度,进而参与调控杨树的径向生长,该研究为进一步揭示PagFBL3基因参与杨树茎部生长发育的分子机制提供了参考。

杨树蔗糖转运体基因PagSUT4的鉴定及功能分析

【目的】植物蔗糖转运体SUTs参与蔗糖由源组织到韧皮部的装载、韧皮部的运输和由韧皮部到库组织的卸载过程,对植物生长发育至关重要。本研究通过在杨树中超表达Pag SUT4基因(Gen Bank登录号:KX545405)并分析转基因株系的表型,探讨Pag SUT4在杨树糖转运、光合作用和次生生长中的作用。【方法】利用同源基因克隆技术,克隆银腺杨Pag SUT4基因;利用实时荧光定量PCR技术,分析银腺杨Pag SUT4基因在根、幼叶、成熟叶、初生茎、次生茎、雄花和雌花及木质部、韧皮部中的表达。通过在烟草叶片瞬时转化35 S∶YFP-Pag SUT4,对Pag SUT4的亚细胞定位进行分析。利用Gateway技术,将Pag SUT4编码区序列重组进入PMDC32载体,从而构建35 S∶Pag SUT4载体。利用农杆菌介导法转化银腺杨,并选取Pag SUT4表达量较高的2个转基因株系用于表型分析。对在温室生长2个月的转基因株系和对照植株的株高、地径、净光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度和蒸腾速率进行测定。此外,通过组织切片对转基因和对照植株的第7节间的解剖学特征进行分析。【结果】Pag SUT4基因编码的蔗糖转运蛋白定位于液泡膜。Pag SUT4基因在各组织中均有表达,并在成熟叶、次生茎、韧皮部和花中具有较高表达。基于实时荧光定量PCR分析,确认获得13个Pag SUT4超表达株系,其Pag SUT4在叶片中的表达量均显著高于对照。2个Pag SUT4超表达株系(S1和S12)的气孔导度、蒸腾速率和水分利用效率均高于对照,而其胞间CO2浓度低于对照;净光合速率显著高于对照,分别高出24%和21%;与对照相比,株高分别增加22%和17%,地径分别增加9%和7%。茎解剖分析发现,2个Pag SUT4超表达株系第7节间木质部宽度与对照株系相比分别增加32%和21%。【结论】Pag SUT4基因主要在成熟叶、次生茎和韧皮部及花中发挥作用。杨树超表达Pag SUT4可能通过促进叶片中糖的外运和茎中糖的运输与卸载,提高蔗糖在源端的装载及在库端的卸载效率进而对光合作用产生正反馈效应。光合作用的增强和茎中蔗糖卸载效率的增加,促进杨树的高生长和径向生长(次生木质部发育)。

马铃薯StXYLP基因家族的生物信息学分析

[目的]在马铃薯基因组水平上鉴定木质形成素类蛋白(Xylogen-like protein,XYLP)基因家族,分析其理化性质及基因的表达模式。[方法]用生信学方法鉴定马铃薯XYLPs,分析其理化性质、亚细胞定位、进化关系、蛋白质结构、基因结构和染色体定位。利用芯片数据分析马铃薯StXYLPs的时空表达模式及对非生物胁迫的响应。[结果]马铃薯中共有20个StXYLPs;蛋白全长在139~221氨基酸之间,理论等电点在4.36~9.42之间,均锚定在质膜上;蛋白质结构基本相似,均具有保守的nsLTP结构域;StXYLPs在染色体上的定位具有偏好性;StXYLPs具有明显差异的组织表达模式,响应不同的非生物胁迫。[结论]StXYLPs与生长素、细胞分裂素和赤霉素共同调控马铃薯器官发育,19个StXYLPs表达受调控。12个StXYLPs受ABA诱导表达上调,在盐、高温及干旱胁迫下,14个StXYLPs受诱导表达上调,参与对抗非生物胁迫。

基于CRISPR/Cas9的毛果杨bHLH106转录因子的功能研究

【目的】采用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制毛果杨(Populus trichocarpa)bHLH106(Basic Helix-Loop-Helix 106)基因的突变体,分析植株的表型特征,初步揭示PtrbHLH106基因在毛果杨木材形成过程中的功能。【方法】基于前期对毛果杨野生型(WT)茎干的不同细胞类型(形成层、木质部和韧皮部细胞)RNA-seq数据,克隆得到一个在形成层及木质部较高表达的bHLH基因PtrbHLH106。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制毛果杨PtrbHLH106的功能缺失突变体。对生长60、90、120 d的毛果杨ptrbhlh106突变体和WT植株进行表型观察;对生长120 d的植株各茎节进行石蜡切片,利用甲苯胺蓝染色观察并进行细胞统计分析。【结果】获得毛果杨ptrbhlh106突变体;与WT相比,突变体植株的株高、地径无明显差异;在整个测量的生长周期中,第8茎节长度有缩短的趋势,茎节数量有增加的趋势;形成层细胞层数有增加的趋势但差异不显著,导管细胞孔径显著增大,纤维细胞数量显著减少。【结论】ptrbhlh106突变体与WT植株在导管孔径和纤维细胞数量上存在差异,初步证明PtrbHLH106基因参与了调控毛果杨次生木质部的发育。