多功能木聚糖水解酶的研究及其在食品领域的潜在应用

木聚糖是植物细胞壁中含量最丰富的异质多糖,具有合成高值化生物基产品的巨大潜力。在食品领域,木聚糖经高效酶解转化可产生低聚木糖、木糖醇、阿魏酸等功能性食品多糖。与多酶协同催化相比,兼具多种木聚糖水解酶活性的多功能酶具有生产成本低、催化效率高、酶解工艺简化等显著优势,具有广阔的应用前景。作者首先介绍了不同植物来源木聚糖的结构组成及主链与侧链降解酶系,进而系统综述了近年来多功能木聚糖水解酶在结构、功能及作用机理方面的研究进展及在食品领域中的应用潜力,最后展望了多功能木聚糖水解酶的研究方向,为多功能木聚糖水解酶的精准设计及产业化应用奠定基础。

绿色木霉纤维素酶AS3.3032固态发酵的研究

该研究以麦麸和汽爆蔗渣为主要原料 ,采用绿色木霉AS3 30 32 (Trichodermaviride)固态发酵生产纤维素酶 ,研究了氮源、碳源、表面活性剂、接种方式、培养基含水量、培养温度、培养基起始pH值对绿色木霉产酶活力的影响 .研究结果表明 :①以硫酸铵为氮源 ,其FPA ,CMC ,和 β Gase酶活力均较高 ,每克干曲分别高达 12 2 5FPAU g ,1470 0CMCU g和 119 3β GaseU g ;②碳源以麸蔗比为 3∶2时 ,FPA ,β Gase和CMC酶活力均为最高 ,每克干曲分别高达 138 2FPAU g ,134 6 β GaseU g和 16 0 3 1CMCU g ;③添加 0 1%的Tween 80和 0 5 %～ 0 7%的洗衣粉可分别提高FPA ,β Gase和CMC为 2 3倍、2 8倍、2 3倍和 3 1倍、3 7倍、3 0倍 ;④培养基含水量、培养温度、培养起始pH值分别为 2 5 0 % ,2 8℃和pH3 5 。

里氏木霉Rut C-30产非淀粉多糖酶发酵条件的研究

在接种量与培养温度分别为8%和30℃条件下,采用正交试验表L9(34)设计对培养基组成、发酵时间、培养基湿度和发酵容器4个试验因子进行产酶影响力排序和条件组合优化,同时分析各指标间相关性。结果:对纤维素酶,培养基组成>发酵时间>发酵容器>初始湿度,最优组合酶活力456.3u/g;对木聚糖酶,发酵时间>培养基组成>发酵容器>初始湿度,最优组合酶活力5529.9u/g;对β-甘露聚糖酶,发酵容器>培养基组成>初始湿度>发酵时间,优化组合酶活力367.6u/g;对果胶酶,培养基组成>发酵容器>发酵时间>初始湿度,最优组合酶活力为544.6u/g;培养基发酵失重与β-甘露聚糖酶活力极显著正相关(r=0.811,P<0.01)、纤维素酶与木聚糖酶活力显著正相关(r=0.724,P<0.05)。结论:通过改变发酵条件可调控该菌株产饲用NSP酶谱的酶活水平与比例,指标之间相关性可用于监测发酵过程中的酶活力状态。该菌株较适合作为饲用NSP复合酶制剂生产的菌株。

以里氏木霉制备纤维素酶的研究

以里氏木酶(Trichoderma reesei Rut C-30)为产酶菌株,采用不同纤维底物(麸皮,玉米皮及玉米秸杆)制备纤维素酶,研究其酶解效果及酶系构成。研究表明,玉米秸杆底物最佳,滤纸酶活达到1.87 IU/mL,产酶收获期为112 h,麸皮底物收获期最短,达48h,但滤纸酶活最低,达0.76 IU/mL,产酶时间长短将影响酶系构成,时间长酶系结构合理,滤纸酶活高。

瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的分离与鉴定

将在木聚糖上生长的瑞氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０的ｃＤＮＡ文库全部质粒转化已携带有毕赤氏酵母（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）木糖还原酶基因的重组酿酒酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株Ｈ４７５，在Ｈ４７５中构建了瑞氏木霉的ｃＤＮＡ表达亚文库。在以木糖为唯一碳源的选择性酵母合成培养基上，从该亚文库中筛选到瑞氏木霉木糖醇脱氢酶ｃＤＮＡ基因，该基因片段长为１３ｋｂ。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交分析和蛋白质凝胶电泳结果表明该基因确实来源于瑞氏木霉，所编码蛋白质分子量约为４０ｋＤａ。携带有毕赤氏酵母木糖还原酶和瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的重组酵母能够在以木糖为唯一碳源的培养基上生长，并能将９０％以上的木糖转化为木糖醇、乙醇和其它副产品。

Pichia stipitis木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2.将该基因连入酵母表达载体pYX212的强启动子磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子下,得到融合表达载体pYX-XYL2.通过电转化方法将pYX-XYL2转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A中,酶活测定表明在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2得到活性表达,酿酒酵母转化子粗酶液中木糖醇脱氢酶比活为每毫克蛋白0.6 U左右,约为供体菌的2.4倍.与基因供体菌不同,木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导,为组成型表达.

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.

木糖醇脱氢酶研究进展

综述了木糖醇脱氢酶研究现状,包括木糖醇脱氢酶的提取、结构、理化性质以及辅酶改造,同时对利用生物技术进行木糖醇脱氢酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。

木糖醇脱氢酶基因高拷贝表达载体构建及在酿酒酵母中的表达

木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)可以氧化木糖醇生成木酮糖,处于木糖代谢的节点位置。利用PCR方法克隆得到了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)20335的木糖醇脱氢酶基因、质粒p KT0150的ADH1终止子序列和G418抗性基因(KanR),以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5特定的2.2 kb的r DNA片段。以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架,利用基因工程手段构建一个多拷贝整合表达载体p LXAGRX。将重组载体p LX-AGRX线性化转入到酿酒酵母W5后,通过高浓度G418筛选和PCR双重鉴定,证实重组载体p LX-AGRX已整合到酿酒酵母W5基因组上,测定木糖醇脱氢酶酶活可达65.957 4 U/mg。

加味木防己汤对类风湿关节炎大鼠滑膜的基质金属蛋白酶生成的影响

目的:探讨加味木防己汤对佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜细胞基质金属蛋白酶(MMP)生成的影响及其可能的分子机制。方法:将Wistar大鼠随机分4组,每组10只,并应用弗氏完全佐剂诱发大鼠AA实验性模型,造模18d开始给药,第40天处死大鼠取膝关节滑膜组织体外进行原代细胞培养,通过明胶酶谱分析法检测加味木防己汤对AA大鼠滑膜细胞MMP-2和MMP-9生成的影响。结果:①正常组大鼠滑膜细胞仅产生MMP-2;②在TNF-α(10μg/L)存在下,正常组大鼠可表达MMP-9,AA组大鼠滑膜细胞MMP-2和MMP-9生成量增加;③加味木防己汤治疗组大鼠滑膜细胞,在无干预情况下MMP-2和MMP-9的表达量均显著降低,在TNF-α存在时MMP-9的表达量未见明显增加。结论:加味木防己汤不仅能抑制AA大鼠滑膜细胞生成MMP-2和MMP-9,同时也能抵抗TNF-α对AA大鼠滑膜细胞生成MMP-9的刺激作用。提示加味木防己汤可能具有调控类风湿关节炎发病的作用。

带有木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母的构建

采用双载体系统，将携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒pAJ401－Xdh1转化已带有树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母H475，构建了同时带有毕赤氏酵母木糖还原酶基因和瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母HX1。研究了重组酿酒酵母HX1对木糖的转化利用情况。

木糖代谢酶系基因的克隆与表达

自然界中,许多细菌和一些酵母、丝状真菌都能利用木糖。在原核生物中,木糖代谢一般须有三种酶参与,即木糖通透酶、木糖异构酶和木酮糖激酶。在木糖通透酶作用下,木糖进入细胞,然后被木糖异构酶异构化为木酮糖。

里氏木霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的工艺研究

研究了里氏木霉β-葡萄糖苷酶的酶学性质，及其水解大豆异黄酮糖苷能力。该酶反应的最适温度为50℃，最佳pH为5．0；此酶在pH4．5～5．5之间和低于60℃下酶较稳定，在80℃基本无活力。采用里氏木霉β-葡萄糖苷酶水解的方法，将大豆异黄酮糖苷转化为苷元，以染料木苷水解率为检测指标。通过正交试验确定了该酶水解大豆异黄酮的工艺奈件为反应温度50℃、水解时间90min、水解介质pH4．5、加酶量20U，大豆异黄酮中染料木苷的水解率为99％。

休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)木糖醇脱氢酶基因(xyl2)克隆与序列分析

根据木糖醇脱氢酶基因序列相似的特点,根据树干毕赤酵母(Pichia.stipitis),热带假丝酵母(Candida tropicalis)设计1对简并引物获得C.shehatae HDYXHT-01木糖醇脱氢酶基因的序列,此片段长为1095bp。利用生物信息学软件对此序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、CDS分析、二级结构预测。结果表明,该克隆片段为C.shehatae HDYXHT-01木糖醇脱氢酶基因的序列。

漆酶活化木素提高未漂硫酸盐浆的湿强度

在传统的木质纤维加工过程中,增强剂可以使最终产品获得较好的机械强度,这些增强剂包括用于中密度纤维板生产的合成树脂和广泛用于纸张生产的湿强剂。由于环保和经济的原因,人们开始研究淘汰合成增强剂生产人造板和纸张的新生产工艺。漆酶催化木素氧化可以促进木质纤维间的自粘合性,本文综述了使用漆酶、漆酶/木素抽出液及漆酶/介体处理高得率未漂硫酸盐化学浆可以不同程度地提高未漂浆的湿强度,但干强度没有改善。

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析

旨在克隆滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因GrDXS,并进行表达分析。以滇龙胆转录组为基础,采用RTPCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrDXS基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。滇龙胆GrDXS基因(登录号:KJ624995)全长2145bp,编码714个氨基酸;GrDXS蛋白相对分子质量76.75kD,pI为6.93;属于DXS家族成员,可能定位于叶绿体;主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;具有DXS蛋白的4类保守结构域:焦磷酸硫胺素结合折叠域(IPR029061,69-425、366-555、87-268、315-407、407-558)、类转酮酶嘧啶结合结构域(IPR005475,394-559、394-555)、转酮酶C端/丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结构域II(IPR009014,568-704,572-704)、转酮酶C端结构域(IPR005476,573-696)和1个转酮酶结合位点(IPR020826,500-516);与长春花CrDXS蛋白亲缘关系最近;GrDXS基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为100kD,与预期蛋白大小一致;GrDXS基因主要在叶中表达。

绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ基因的克隆与表达

采用RTPCR方法克隆到绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)的cDNA序列,测序后构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上,转化酿酒酵母,转化子用2%的βD半乳糖进行诱导,用Northern杂交、刚果红染色法和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测.结果表明,EGⅠ的cDNA基因开放阅读框长度为1377bp,编码459个氨基酸,推测蛋白质分子量为48.1kD.刚果红染色显示,转化子可产生明显的水解圈;CMC酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EGⅠ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在培养60h达到最高0.06UmL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.4.

利用定点突变改变树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖醇脱氢酶辅酶特性的研究

在酿酒酵母中同时表达木糖还原酶基因(xyl1)和木糖醇脱氢酶基因(xyl2)可使酿酒酵母利用木糖发酵生成乙醇。但由于两种酶所依赖的辅酶不同导致酿酒酵母细胞内氧化还原失衡,致使中间产物大量积累,降低了乙醇产率。本研究从树干毕赤酵母中克隆了木糖醇脱氢酶基因,通过与银叶粉虱山梨醇脱氢酶[其活性依赖NADP^+(H)]序列进行对比,确定突变位点,并利用融合PCR的方法进行定点突变。结果表明,突变体对辅酶NADP^+(H)的亲和力有不同程度的提高,其中三点突变体的辅酶特性得到明显改变。本研究为构建高效利用木糖发酵生成乙醇的重组酿酒酵母奠定了基础。

高效表达木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母的构建及木酮糖发酵的初步研究

通过RT-PCR方法克隆得到Candida tropicalis木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因连入酵母表达载体pYES2的诱导型启动子GAL1下,构建表达质粒pYES2-xyl2;同时用从Pichia pastoris中克隆获取的甘油醛磷酸脱氢酶基因GAP换下GAL1基因,构建含组成型启动子GAP基因的表达质粒pYES2-GAP-xyl2;通过电转化法将其依次转入酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1,山梨醇培养基上筛选的转化子经木糖醇梯度驯化培养,筛选出1株耐木糖醇浓度为20%的酿酒酵母重组菌株ZCX4和1株在半乳糖诱导下耐木糖醇浓度为15%的重组菌株YDX2。酶活测定表明,重组菌株ZCX4比酶活0.621 U/mg(蛋白),是YDX2比酶活的2.29倍。摇瓶发酵结果显示,重组菌株ZCX4木糖醇消耗76.46 g/L,木糖醇消耗率为76.46%,是重组菌株YDX2木糖醇消耗率的1.63倍,说明木糖醇脱氢酶实现了高效表达。

紫花苜蓿β-1,2-木糖转移酶同源建模及分子动力学分析

[目的]研究紫花苜蓿β-1,2-木糖转移酶同源建模及分子动力学。[方法]通过NCBI数据库得到了紫花苜蓿β-1,2-木糖转移酶的mRNA及氨基酸序列,应用Swiss-mode在线预测了该蛋白质的三维结构。[结果]Ramachandram结构检测表明,建立的三维模型其蛋白质残基的二面角有95%以上位于黄色能量稳定区域,符合立体化学能量规则。NAMD软件分子动力学分析得到该蛋白质的能量图谱与计算红外光谱,表明其催化反应在热力学稳定范围内。[结论]为深入研究β-1,2-木糖转移酶的结构提供了理论依据。