日本血吸虫未成熟虫卵26/28kDa抗原诱导抗雌虫生殖和抗卵胚发育免疫的研究

目的 :探讨日本血吸虫未成熟虫卵的 2 6/ 2 8k Da抗原 ( SIEA2 6/ 2 8k Da)诱导小鼠产生抗雌虫生殖免疫的效果。方法 :采用纯化的 SIEA2 6/ 2 8k Da抗原以及 SIEA- I抗原 ,分别免疫BAL B/ c小鼠 ,于攻击感染后 4 6d进行粪卵、组织内虫卵定量。结果 :证明 SIEA2 6/ 2 8k Da抗原能诱导小鼠产生抑制雌虫生殖的免疫力。与对照组比较 ,SIEA2 6/ 2 8k Da抗原免疫鼠减虫虽不明显 ,但肝组织内总卵数、成熟卵数和粪卵数 ( EPG)分别减少 4 8.1%、83.6%、87.3% ,死亡卵数明显增加 ( P<0 .0 0 1)。此外 ,未纯化的 SIEA和纯化的 SIEA2 6/ 2 8k Da抗原免疫组均见雌虫子宫内虫卵数下降 ,分别达 4 0 .9%、54.8% ,而 SEA和 SIEA- I抗原免疫未见上述效应。结论 :提示抗雌虫生殖免疫和抗卵胚发育的效应 ,主要与 SIEA2 6/ 2 8k Da蛋白组分有关。

日本血吸虫未成熟虫卵糖蛋白抗原生物学特性的初步分析

目的 分析日本血吸虫未成熟卵糖蛋白抗原的生物学特性。方法 利用 SDS- PAGE、银染色、PAS及脂类染色对 SIEA组分进行分析 ,并根据标准分子量迁移率 Rf值 ,用半对数坐标纸绘图 ,测算各区带的分子量。结果 SIEA有 10种糖蛋白分子 ,其分子量为 10 1、97、91、87、77、74、6 6、6 2、5 6、5 0 k Da;1条 37k Da脂蛋白区带。结论 SIEA含有蛋白、糖蛋白、脂蛋白等抗原分子 。

日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26～28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26～28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4.SIEA26～28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26～28ku的编码基因奠定了基础.

日本血吸虫天然抗病分子疫苗的结构与功能分析 Ⅰ.未成熟卵28kDa分子的快速分离纯化与鉴定

为了进一步研究日本血吸虫天然抗病分子(SIEA 28 kDa)的结构与功能,采用SDS-PAGE制备电泳和电洗脱法从日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原(SIEA)中快速分离纯化了SIEA 28 kDa抗原分子,纯化后抗原分子经梯度凝胶电泳分离,重复测定其分子量。同时,采用Western blot和ELISA检测SIEA 28 kDa分子的免疫活性及其生化纯度。证实获得的提取物SIEA 28 kDa抗原分子的纯度高、活性好;用该抗原分子免疫家兔获得的单特异性抗血清可同时识别日本血吸虫未成熟虫卵、雌虫和雄虫的28 kDa抗原组分。说明该分子与日本血吸虫成虫(AWA)28 kDa组分具有部分交叉抗原性。

日本血吸虫未成熟卵免疫血清抗卵胚反应的观察

目的研究日本血吸虫未成熟卵免疫血清在抗卵胚方面的作用。方法采用多途径免疫新西兰家兔的方法,制备日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原的免疫兔血清,通过免疫酶染色定位观察免疫血清与未成熟卵胚的反应。结果证明未成熟卵免疫血清能特异地识别虫卵早期胚胎抗原,与未成熟虫卵卵胚出现较强的免疫反应。结论未成熟虫卵可溶性抗原免疫产生的抗卵胚作用与未成熟虫卵胚胎抗原所诱导的保护性免疫应答有关。

抗日本血吸虫生殖抗原SIEA 26-28ku组分的质谱分析

目的筛选确定抗日本血吸虫生殖功能抗原SIEA26-28 ku的编码基因。方法采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原(SIEA),选择SIEA 26-28 ku免疫血清识别信号较强的SIEA-2D蛋白质斑点(65～73号)采样,消化处理后进行质谱与生物学信息分析。结果从SIEA-2D图谱上共获得1037个蛋白质斑点;通过MALDI-TOF-MS对其进行肽指纹图谱分析后获得了7张肽指纹图谱。通过PeptIdent软件检索SWISS-PROT数据库,发现有意义的血吸虫同源蛋白质11个,这些同源蛋白质部分与细胞代谢或蛋白质合成代谢相关,部分与核苷酸代谢有关,其中编号为SIEA-2D66为日本血吸虫次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),SIEA-2D71为琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SDISP),SIEA-2D73为谷胱甘肽-S-转移酶(GST),其同源程度分别为37.2%、18.7%和22.9%。结论初步获得与抗日本血吸虫生殖功能抗原SIEAn 26～28 ku相关的编码基因HGPRT、SDISP和GST。

日本血吸虫SIEA66-68kDa抗原的分离、纯化及免疫保护性研究

目的研究日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原66-68kDa(SIEA66-68kDa)的动物免疫保护力,并对其作为天然分子疫苗的可行性进行评估。方法采用电泳切胶、电洗脱、超滤离心等技术,分离纯化SIEA66-68kDa天然分子抗原,免疫小鼠,待其产生抗体后进行尾蚴攻击感染(40尾/只),计算减虫率和减卵率。结果 SIEA66-68kDa天然蛋白质分子能刺激机体产生抗日本血吸虫的作用,其减虫率为41.70%,每克肝脏减卵率为51.23%,雌虫子宫减卵率为29.30%,每克大肠减卵率为59.26%,每克粪便减卵率为45.17%,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 SIEA66-68kDa天然分子抗原具有刺激小鼠产生较好的抗日本血吸虫感染的免疫保护作用,可作为抗日本血吸虫感染候选分子疫苗的靶标。

SIEA免疫血清对体外培养的日本血吸虫卵胚胎发育的作用

目的 采用体外培养方式 ,探讨日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原 (SIEA )免疫血清的抗卵胚胎发育作用。方法 从日本血吸虫小鼠肝脏无菌分离提取虫卵 ,转入 RPMI- 16 40培养基中 ,对照组与试验组分别加入正常鼠血清和 SIEA免疫血清。试验 1:培养虫卵 30 d;试验 2 :培养虫卵 14d。观察统计各期虫卵比较。结果 在试验 1中 ,SIEA免疫血清组成熟卵比例与对照组比较 ,下降 2 2 .5 % ,初产卵、胚胎卵和死亡卵比例均高于对照组。在试验 2中 ,SIEA免疫血清组成熟卵比例下降 14.7% ,胚胎卵比例上升 2 4.4%。结论 体外培养系统中 SIEA免疫血清具有抗日本血吸虫卵胚胎发育的作用。

被动转移抗SIEA-Gp101血清对人工感染日本血吸虫鼠肺虫卵肉芽形成的影响

目的 了解SIEA Gp10 1对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响。方法 采用虫卵肉芽肿肺模型对SIEA Gp10 1的作用进行研究。将 36只昆明鼠随机分为 5组 ,各组被动转移的成分分别为 :抗SIEA Gp10 1,抗SIEA2 8kDa ,抗SIEA Gp10 1与抗SIEA2 8kDa混合血清 ,同时设正常兔血清组与生理盐水对照组。分别于第 1、3、5天尾静脉注射抗血清、正常兔血清或生理盐水 ,各组于第 2天注射日本血吸虫成熟虫卵 ,第 8天取鼠肺组织切片 ,观察虫卵肉芽肿变化并测量、比较虫卵肉芽肿大小。结果 正常兔血清组与生理盐水组相比 ,虫卵肉芽肿大小无统计学差别 (P >0 0 5 ) ;与正常兔血清组比较 ,实验组虫卵肉芽肿的大小分别下降了 18 0 8%、2 8 30 %和 6 44 % ,其中抗SIEA2 8kDa差别显著 (P<0 0 5 ) ,抗SIEA Gp10 1和混合血清组差别不显著 (P >0 0 5 )。肉芽肿内外细胞成分的观察显示 ,正常兔血清组与生理盐水组无明显的差别 ;而抗SIEA2 8kDa血清被转组 ,虫卵破坏加快 ,部分虫卵卵内仅见残渣和少量炎性细胞。抗SIEA Gp10 1与混合血清组部分虫卵坏死 ,有一定数量的炎性细胞浸润。结论 SIEA2 8kDa分子具有抗卵胚发育和抑制虫卵肉芽肿形成的作用。混合血清组较抗SIEA2 6 2 8kDa组虫卵破坏较轻 ,虫卵肉芽肿增大 ,细胞数量增多 。

SIEA-Gp101分子抗原的分离纯化及其单特异性抗血清的制备

应用SDS PAGE、电渗、透析等方法 ,分离纯化SIEA Gp10 1分子抗原。采用多途径免疫法制备单特异性抗血清 ,琼脂扩散试验和ELISA测定抗体的效价 ,SDS PAGE和ELIB检测抗体的特异性。结果表明纯化的SIEA Gp10 1为单一抗原分子 ,对SIEA Gp10 1的抗血清进行ELIB分析 ,证明其仅识别SIEA Gp10 1抗原 ,说明SIEA Gp10 1分子具有抗原性。

抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究

目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位，探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因．克隆至PET32a／SIEA26～28kDa-scFv质粒，构建PET32a／EGFP-scFv质粒。转化至感受态E．coli BL21（DE3）中。并诱导表达单链抗体融合蛋白。分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性。单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育，荧光显微镜下观测GFP信号。确定特异性单链抗体的靶向性。结果重组质粒PET32a／EGFP-scFv构建成功．Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达．与SIEA26-28kDa特异性结合。GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚．雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织。结论SIEA26-28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性，具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用，为SIEA26-28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础。

日本血吸虫天然抗原分子的柱层析分离纯化与鉴定

目的分离纯化日本血吸虫成虫(AWA)和未成熟虫卵(SIEA)可溶性抗原中的单一蛋白,为血吸虫病免疫诊断、预防提供新的抗原分子。方法柱层析分离纯化成虫和未成熟虫卵可溶性抗原,SDS-PAGE及银染色进行分析鉴定。结果得到了三种不同大小血吸虫分子抗原AWA18000u,SIEA42000u,SIEA130000u。结论实验证明柱层析法是一种快速分离纯化血吸虫单一组分抗原简单而有效的方法。