冻存人类未成熟卵母细胞的研究进展

冻存人类未成熟卵母细胞体外成熟有广阔的应用前景.经过20多年的探索,研究主要集中在小鼠、牛等哺乳动物的未成熟卵母细胞,冷冻方法也不尽相同,解冻后卵母细胞的存活率及胚胎发育潜力低.虽然经不同冷冻方法保存的人未成熟卵母细胞出生的婴儿国外已有个别报道,但是获得妊娠的机率还非常有限.本文将从人类未成熟卵母细胞的冻存优势、冷冻方法及影响因素等方面综述如下.

小鼠未成熟卵母细胞体外培养

目的 :探讨小鼠未成熟裸卵体外培养 ,获得较高的成熟率和受精率的适宜培养时间和培养条件 .方法 :在培养液中添加不同剂量的人绝经期促性腺激素 (hMG)和卵泡刺激素 (FSH) ,分别培养从未行激素刺激排卵处理的昆明系小白鼠卵巢中获得的未成熟裸卵 ,培养 2 4h和 4 8h后 ,进行体外受精和胚胎培养 .结果 :添加不同激素和培养不同时间对未成熟裸卵的体外成熟无显著性影响 (P >0 0 5) ,但黄体生成素 (LH)的存在对培养 4 8h后成熟卵子的体外受精率有显著性影响 (P <0 0 5) ,并随LH含量的增多 ,影响也越大 .结论 :未成熟裸卵能在体外培养成熟并受精 。

人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究

目的:探讨玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的有效性。方法:根据有无颗粒细胞将实施玻璃化冷冻的GV期卵母细胞分为含颗粒细胞(非裸卵)组和不含颗粒细胞(裸卵)组;将部分GV期卵母细胞体外培养至MⅡ期卵母细胞实施玻璃化冷冻,比较非冷冻IVM组与MⅡ卵玻璃化冷冻组间、裸卵组与非裸卵组间的存活率、成熟率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果:非裸卵组的成熟率大于裸卵组(P<0.05),而存活率、受精率、2-细胞形成率、>2-细胞形成率之间均无统计学差异(P>0.05)。另外,非冷冻IVM组与GV玻化组间成熟率、受精率、卵裂率均存在显著性差异(P<0.05);非冷冻IVM组与MⅡ期卵玻化组间成熟率、受精率、卵裂率间均存在统计学差异(P<0.05);GV玻化组与MⅡ玻化组间存活率、成熟率、受精率、卵裂率间均无统计学差异(P>0.05)。结论:玻璃化冷冻未成熟卵母细胞需要保留颗粒细胞,同时初步构建了人GV期卵的玻璃化冷冻联合IVM技术的雏形。

冻融体外受精-胚胎移植周期人未成熟卵母细胞的体外成熟及纺锤体结局

目的:探讨冻融的不同状态人未成熟卵母细胞体外成熟后纺锤体状态与受精率的关系。方法:随机收集本中心108个体外受精-胚胎移植周期(IVF)中183枚不同状态废气的成熟卵母细胞,分为:卵丘-卵母细胞复合物组,48枚;裸卵组,135枚,其中第一次减数分裂中期(MI)65枚,生发泡期(GV)70枚。玻璃化冷冻保存,经解冻、体外培养成熟后,应用Polscope成像系统观察纺锤体,然后行卵胞浆内单精子显微注射受精,记录各指标情况。结果:①卵丘-卵母细胞复合物组与裸卵组的存活率、体外成熟率、纺锤体出现率、受精率比较,均无统计学差异(P>0.05);②GV组的存活率显著高于MI组(P<0.05),而前者的体外成熟率显著低于后者(P<0.05);③各组体外成熟后有纺锤体出现的卵母细胞受精率均显著高于无纺锤体组(P<0.05,P<0.01)。结论:冻融IVF周期不同状态的人未成熟卵母细胞都有一定发育潜能;有纺锤体出现的冻融人未成熟卵母细胞质量较高。

褪黑素对ICSI周期中人未成熟卵母细胞体外成熟结果的影响

目的探讨褪黑素的应用对卵胞浆内单精子注射(ICSI)周期中人未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)、受精和胚胎发育的影响。方法收集的人未成熟卵母细胞随机置于含褪黑素和不含褪黑素的IVM培养液中进行IVM培养,记录和分析未成熟卵IVM以及所获胚胎的发育情况。结果用含褪黑素IVM培养液培养的未成熟卵母细胞为褪黑素组(n=94),IVM培养成熟78枚,ICSI后受精60枚,培养后卵裂59枚,发育至囊胚26枚,其14枚为优质囊胚,而非褪黑素组(n=73),IVM培养成熟60枚,ICSI后受精44枚,培养后卵裂42枚,随后11枚发育至囊胚,仅1枚优质囊胚。两组间成熟率、受精率、卵裂率及囊胚率差异无统计学意义(P>0.05),但褪黑素组的优质囊胚率明显高于非褪黑素组(53.8%vs 9.1%),差异有统计学意义(P<0.05,χ2=6.42)。结论褪黑素的应用改善了IVM效果,使人未成熟卵母细胞在IVM、ICSI及胚胎培养后发育更多的优质囊胚。

未成熟卵母细胞冻存

随着人类辅助生殖技术的发展,人未成熟卵母细胞的冷冻技术因其特有优势得到了较多的关注,研究数据支持未成熟卵母细胞冻存是保存女性生育力的一种有临床应用前景的方式。冷冻和复融过程会对卵母细胞造成一系列形态结构、细胞代谢、生理生化及发育潜能的影响。作为一个较新的方向,未成熟卵母细胞的冷冻技术缺乏标准方案,很多相关研究成果尚存在争议。本文着重未成熟卵母细胞冷冻技术的意义、优势、影响因素等方面的新观点予以综述。

核抑制剂(Roscovitine)对促排周期人未成熟卵母细胞体外成熟安全性的初步研究

目的观察核抑制剂(Roscovitine)对人未成熟卵母细胞体外成熟(in vitromaturation,IVM)安全性的影响。方法获取促排周期的GV期未成熟卵随机分为两组,实验组(经二步法):未成熟卵母细胞先用含有200μmol/LRoscovitine的培养液培养6 h,然后转入IVM成熟培养液培养24～36 h;对照组:直接用IVM成熟培养液培养24～36h。观察两组卵母细胞成熟情况并应用激光扫描共聚焦显微镜观察培养成熟后MⅡ期卵母细胞纺锤体和染色体的形态。结果实验组共获未成熟卵母细胞61个,经体外成熟培养后50个卵成熟,其中39个卵可观察到纺锤体与染色体,纺锤体的形态异常者为15个,染色体异常者11个;对照组共获未成熟卵母细胞60个,经体外成熟培养后43个卵成熟,其中32个卵可观察到染色体与纺锤体,纺锤体形态异常者14个,染色体异常者11个。结论Roscovitine能可逆性抑制体外培养的人卵母细胞的核成熟,但未对纺锤体及染色体形态产生不良影响。

卵丘细胞在未成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存中的作用

卵母细胞冷冻技术是生殖医学的一大热点,未成熟卵母细胞冻存是保存女性生育力的重要方法,具有广阔的临床应用前景。卵丘细胞与卵母细胞共处同一微环境,二者通过缝隙连接进行复杂的双相调控和物质交换,目前已知卵丘细胞在人类未成熟卵母细胞体外成熟过程中具有重要作用,但在冷冻过程中的作用尚无定论。随着玻璃化冷冻技术的发展,卵丘细胞对未成熟卵母细胞冷冻的影响有了较多的研究,卵丘细胞可减缓冷冻剂渗透速率,从而避免细胞渗透压的突变对未成熟卵母细胞的损伤,提高细胞冻融后存活率和受精率并支持未成熟卵母细胞的体外成熟。就卵丘细胞在人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存中的作用进行综述,为癌症化疗、延迟生育年龄等需进行的未成熟卵母细胞冷冻提供重要的理论基础及可靠的实验依据。

人未成熟卵母细胞冷冻技术进展

人成熟卵母细胞的纺锤体对低温敏感,在冷冻保存中极易受到伤害,加上成熟卵母细胞来源有限,人们开始研究人未成熟卵母细胞的冷冻保存。本文综述了人未成熟卵母细胞冷冻技术的意义、优势、影响因素以及目前存在的关键问题,期望能拓展配子冷冻领域。

小鼠未成熟卵母细胞OPS法冷冻保存技术的研究

试验用OPS法对小鼠未成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻保存研究,并对解冻后小鼠未成熟卵母细胞的成熟情况进行观察。结果表明:小鼠未成熟卵母细胞在10%EG、10%DMSO前处理后,在EFS30、EFS40、EDFS30和EDFS40中平衡15～45s进行冷冻保存,使卵母细胞解冻后的形态正常率最高达92.4%,与对照组无显著差异(P>0.05),成熟率达40.5%。

小鼠巨细胞病毒对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的影响

目的 探讨小鼠巨细胞病毒对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法 将未成熟小鼠卵母细胞置于含 10 0TCID50 、10TCID50 、1TCID50 小鼠巨细胞病毒的培养液中培养 ,观察卵母细胞的生发泡破裂率和第一极体的释放率 ,并应用电镜观察卵母细胞超微结构。结果 各组的卵母细胞生发泡破裂率和第一极体的释放率差异无显著性 ,10 0TCID50 组未出现卵母细胞超微结构异常。结论 小鼠巨细胞病毒对未成熟卵母细胞体外成熟发育无重大影响。

人未成熟卵母细胞体外成熟培养在多囊卵巢综合征不孕妇女中的应用

目的:探讨未成熟卵母细胞体外成熟培养-胚胎移植技术(IVM-ET)在多囊卵巢综合征(PCOS)患者不孕症治疗中的临床应用前景。方法:将39例PCOS不孕妇女分未成熟卵母细胞体外成熟培养(IVM)组和常规体外受精/卵胞浆内单精子显微注射(IVF/ICSI)组。IVM组:11例PCOS患者,用小剂量促性腺激素(Gn)刺激后取未成熟卵母细胞体外培养28h,行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI),继续培养3d后行胚胎移植。IVF/ICSI组:28例PCOS患者,用常规IVF/ICSI技术助孕。结果:IVM组获卵数123枚,体外培养成熟率为82.93%(102/123),受精率为98.04%(100/102),卵裂率为92.00%(92/100),优胚率为39.13%(36/92),移植10个新鲜胚胎周期,临床妊娠2例,临床妊娠率为2/10,累计妊娠率4/11。与同期28例施行IVF/ICSI的PCOS患者进行比较,其Gn天数、用量、HCG日E2水平、获卵数、优胚率显著低于IVF/ICSI组,差异有统计学意义(P<0.05);卵裂率无明显差异(P>0.05);种植率、临床妊娠率均低于IVF/ICSI组,但差异无统计学意义(P>0.05);IVM组无中重度卵巢过度刺激综合征(OHSS)和自然流产的发生,而IVF/ICSI组中重度OHSS发生率为10.71%(3/28)、自然流产率为3/10,但差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:IVM技术为PCOS患者的治疗开辟了一条新的途径,同时在减少外源性Gn用量,有效控制卵泡数量和E2水平方面具有明显优势。但对其能否降低OHSS风险以及成功率较低等问题,有待进一步研究。

OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察

目的:探讨OPS(open pu lled straw,开放式拉细麦管)法玻璃化冷冻技术冻存未成熟卵母细胞的效果。方法:小鼠GV期卵母细胞用OPS法玻璃化冷冻复苏后行体外成熟培养(in-vitro m aturation,IVM)或直接行IVM,所获成熟卵行体外受精(IVF)和胚胎的体外培养(IVC)。以体内成熟卵行IVF/IVC作为in-vivo对照组。结果:GV期卵冻融后65.11%存活,IVM后成熟率为52.86%,其成熟率显著低于IVM对照组。冻融卵成熟后受精、卵裂率(33.78%、76.00%)低于IVM对照组和in-vivo对照组,培养后未见囊胚形成。结论:OPS法玻璃化冷冻技术可有效冻存GV期卵母细胞,复苏后可发育成熟,但卵的受精和继续发育能力欠佳。

多囊卵巢综合征患者卵丘形态与未成熟卵母细胞发育潜能关系

目的研究多囊卵巢综合征患者无刺激周期取出的不同形态未成熟卵母细胞的发育潜能。方法43例PCOS不孕患者进行了47个未成熟卵母细胞体外成熟培养(IVM)周期。所有患者均未经促卵泡素刺激,予以HCG36h后取卵。根据取出的卵-冠-丘复合物形态将其分为3组:卵丘紧密组、卵丘松散组、无卵丘组。比较3组的体外成熟率、受精率和优质胚胎率。结果47个IVM周期共收集未成熟卵母细胞874枚,体外成熟率61.19%,受精率71.07%,着床率13.13%。卵丘松散组的体外成熟率明显高于卵丘紧密组(72.26%vs49.54%,P<0.05),受精率、优质胚胎率三组间无差异。结论PCOS患者无刺激周期取出的未成熟卵母细胞中,卵丘松散、扩张的卵母细胞具有更好的体外成熟潜力。

人类不同促排卵方案获得的未成熟卵母细胞体外成熟后发育潜能的比较

目的比较体外受精治疗周期中两种不同治疗方案所获得的未成熟卵母细胞经体外成熟培养后的发育潜能。方法根据未成熟卵母细胞来源分为超促排卵组和自然周期组。两组未成熟卵母细胞经未成熟卵母细胞经体外成熟(IVM)后进行常规夫精卵胞浆内单精子注射。比较两组间卵母细胞的成熟率、受精率、卵裂率、优良胚胎率和临床妊娠率的差异。结果超促排卵组受精率、卵裂率和优质胚胎率分别为64.4%、89.9%、17.5%,自然周期组76.7%、100%、33.3%,两组之间的差异无统计学意义(P>0.05),但自然周期组的未成熟卵母细胞的成熟率95.6%、可冷冻胚胎率64.2%及临床妊娠率26.3%均显著高于超促排卵组65.5%、26.2%、0,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论在体外成熟培养中,自然周期获得的未成熟卵母细胞较超促排卵获得的未成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。

人未成熟卵母细胞的体外培养和体外受精

收集人次级卵泡中的卵母细胞(n=69)进行体外培养和体外受精。23个卵母细胞经体外培养后用组织学方法观察,19个(成熟率83％)排出第一极体。46个经体外培养后再进行体外受精的卵母细胞中有24个(受精率53％)成为受精卵。其中有13个(卵裂率54％)在体外发育到2-细胞胚或4-细胞胚。本实验结果提示人次级卵泡中的初级卵母细胞经体外培养可达成熟并具有受精能力。

冻融液的温度对人未成熟卵母细胞玻璃化冻融效果的影响

目的探讨冻融液的操作温度对未成熟人卵母细胞(GV、MI)玻璃化冻融效果的影响。方法收集卵胞浆内单精子注射(ICSI)患者的GV、MI卵母细胞,根据冻融液操作温度的不同分为A、B、C组。冻融后存活及未冷冻对照组(D组)卵母细胞体外成熟(IVM)培养,成熟的MII卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,然后用Nikon CISI激光扫描共聚焦显微镜观察纺锤体、染色体形态。结果实验组GA、GB、GC卵母细胞冻融后的存活率和体外成熟率分别为100%、81.3%、68.8%和33.3%、83.3%、72.7%,仅GC组的存活率与对照比较存在显著性的差异(P<0.05);实验组中只有GB组获得了纺锤体(20%)和染色体(10%)形态正常卵母细胞。实验组MA、MB、MC卵母细胞冻融后的存活率分别为71.4%、100%、83.3%,各实验组与对照组比较无显著性差异(P>0.05);MA组体外成熟率与对照组比较存在极显著性的差异(0%比57.1%,P<0.01),MB、MC与对照组的体外成熟率比较无显著性的差异(66.7%、80%比57.1%,P>0.05);仅MC获得1个正常纺锤体和染色体形态卵子。结论冻融液的合适操作温度可以提高未成熟卵子的冻融效果。