miR-542-3p生物信息学分析及对未成熟猪睾丸支持细胞的影响

为了探讨miR-542-3p的生物信息学信息及其对未成熟猪睾丸支持细胞的影响,试验通过AliBaba 2.1和AnimalTFDB 3.0软件预测miR-542-3p转录因子结合位点(TFBS);并分析miR-542-3p在不同物种间的保守性;采用CCK-8试剂、ATP试剂盒、流式周期检测试剂盒和实时荧光定量PCR方法探究过表达miR-542-3p对未成熟猪睾丸支持细胞的影响;利用TargetScan、miRDB和miWalk 3种在线软件预测miR-542-3p靶基因后取交集,并对猪源靶基因进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析;最后利用Cytoscape 3.2.0软件构建TF-miR-542-3p-靶基因相互作用网络。结果表明:经预测miR-542-3p受GATA1、TBP、Sp1、Ap1、SRF等多个转录因子调控,且在多物种间具有高度的保守性;miR-542-3p可显著或极显著抑制未成熟猪睾丸支持细胞增殖活性(P<0.05或P<0.01),极显著降低细胞内ATP含量(P<0.01),显著或极显著抑制细胞增殖基因和周期基因的相对表达量(P<0.05或P<0.01),进而抑制细胞周期和细胞增殖;转染miR-542-3p mimic后G1期猪睾丸支持细胞比例显著升高(P<0.05),S期细胞比例极显著降低(P<0.01);共发现7个猪源miR-542-3p潜在靶基因,miR-542-3p调控的UBE2E1基因相对表达量极显著下降(P<0.01),KCMF1、ILK基因相对表达量显著下降(P<0.05),HIPK3基因相对表达量极显著升高(P<0.01),AP3D1、PLEKHM3基因相对表达量显著升高(P<0.05),各靶基因主要在激酶活性和结合上发挥作用;miR-542-3p靶基因主要参与MAPK、cAMP、TGF-β和cGMP-PKG等信号通路;构建的TF-miR-542-3p-靶基因相互作用网络包含5个转录因子和50个mRNA。说明miR-542-3p受多种转录因子调控,在多物种间高度保守,能够抑制未成熟猪睾丸支持细胞增殖,并通过调控下游靶基因的表达参与MAPK、cAMP和TGF-β等信号通路,从而调控未成熟猪睾丸支持细胞生长。

未成熟猪心肌深低温低流量体外循环模型的建立

目的探索建立未成熟猪深低温低流量体外循环(CPB)模型的实验方法。方法采用升主动脉-上下腔静脉插管建立未成熟猪CPB模型,待鼻咽温降至32℃阻断升主动脉,继续降温至鼻咽温20～25℃低流量持续灌注,阻断2 h后开放,进行复温、调整停机,停机后观察血流动力学指标2 h。结果停机后20只乳猪均能顺利复跳,平均动脉压、心率在CPB前后比较差异均无统计学意义(P>0.05)。各时间点血细胞比容比较差异有统计学意义(P<0.05),各项血气指标经调整都在正常范围之内。结论未成熟猪CPB模型是更适合临床研究CPB的理想动物模型。

ssc-miR-152生物信息学及对未成熟猪睾丸支持细胞功能的分析

为研究ssc-miR-152生物信息学特征及对未成熟猪睾丸支持细胞功能的影响,本研究通过NCBI数据库确定ssc-miR-152在猪基因组中的位置,通过MethPrimer和EMBOSS在线软件分析ssc-miR-152上游序列CpG岛,使用Netural Network Promoter Predictio和Promoter-2.0预测其启动子区域,结合AliBaba 2.1和AnimalTFDB3.0软件预测其转录因子结合位点;Clustal W软件分析ssc-miR-152在物种间的保守性,采用CCK-8、流式细胞术和实时荧光定量PCR技术检测细胞增殖、周期及凋亡情况,运用miRanda、EIMMO、TargetScan和PITA在线软件预测ssc-miR-152的靶基因并取交集,并对预测的靶基因进行GO功能及KEGG通路分析,最后利用Cytoscape构建TF-miRNA-mRNA互作网络。结果表明:ssc-miR-152位于猪12号染色体反义链的24 292 249~24 292 328位置,其转录起始位点在上游序列200 bp处,启动子范围为393~4 619,并在该范围内存在1个CpG岛,且有RELA、SP1、SRF、IRF1和EGR1等多个转录因子调控ssc-miR-152的表达。同时发现ssc-miR-152具有高度保守性,在未成熟猪睾丸支持细胞中过表达ssc-miR-152后增强细胞增殖活性、加快细胞的周期进程、抑制细胞凋亡率。互作网络显示ssc-miR-152可调控下游NOG、S1PR1和FBN1等多个基因,参与TGF-β、PI3K/AKT和FoxO等信号通路。本研究说明,ssc-miR-152对未成熟猪睾丸支持细胞生长发育有重要作用,本研究为后续进一步探索未成熟猪睾丸支持细胞机理并对雄性精子发生机理提供理论科学依据。