未折叠蛋白响应的激活机制

未折叠蛋白在内质网(endoplasmic reticulum,ER)腔中累积造成ER应激,此时细胞启动未折叠蛋白响应(unfolded protein response,UPR)以恢复蛋白质稳态。目前已知有三种UPR感受器,即IRE1、PERK和ATF6,它们均为ER跨膜蛋白,在ER应激时被激活并启动下游UPR信号通路。虽然UPR感受器最早是在研究细胞如何应对ER应激时发现的,但它们如何感知ER应激至今未得到完满的回答。随着研究的深入,人们发现UPR的功能不仅限于维持蛋白质稳态,而UPR感受器也不是只对未折叠蛋白累积作出响应。本文对UPR的发现及其经典通路作一介绍,着重阐述目前已知的UPR感受器的激活机制,并就UPR和ER应激关系以及该领域存在的问题进行讨论。

未折叠蛋白反应的信号通路

对于真核细胞来说，内质网（endoplasmic reticulum，ER）承担新生蛋白质的折叠、组装和转运。内质网的蛋白折叠机制对了解疾病的发展过程和治疗提供了新的方向，成为当下研究的热点。在蛋白质折叠过程中，由于各种原因会使得未折叠蛋白或错误折叠蛋白增多。然而，在细胞内存在一种机制，这一机制可以通过调整内质网折叠蛋白的数量和加强内质网的折叠能力，来减少未折叠蛋白或错误折叠蛋白的进一步生成，缓解内质网压力，即未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。

稳定表达未折叠蛋白反应荧光报告基因的SH-SY5Y细胞系建立

目的通过稳定表达70 kD热休克蛋白(HSP)4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化。方法以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP。将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中,慢病毒转染SH-SY5Y细胞。使用3μg/ml嘌呤霉素处理细胞1个月,筛选得到HSPA4-EGFP稳转系。通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法,证实HSPA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化。结果扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统。QPCR检测表明,构建的报告系统可以指示UPR。在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布,其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布,分别加入UPR激活剂、抑制剂后,细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带。结论成功构建HSPA4-EGFP稳转系,能够直观实时反映UPR变化,为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具。

ACAC通过未折叠蛋白反应导致奶牛乳腺上皮细胞凋亡

为了探讨乙酰乙酸(acetoacetic acid,ACAC)能否通过激活奶牛乳腺上皮细胞的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)导致奶牛乳腺上皮细胞凋亡,试验用0,0.6,1.2,2.4 mmol/L的ACAC诱导MAC-T 24 h;或用500μg/mL牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)预处理MAC-T 12 h后再加入1.2 mmol/L ACAC处理24 h。使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡率;通过实时荧光PCR方法检测凋亡相关基因[B淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma 2,Bcl2)、Bcl2相关蛋白X(Bcl2 associated X,Bax)、半胱氨酸蛋白酶9(cysteine protease 9,Caspase9)和半胱氨酸蛋白酶3(cysteine protease 3,Caspase3)]与UPR相关基因[葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78 ku,GRP78)、激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和X盒结合蛋白1s(X-box binding protein 1s,XBP1s]的相对表达量。结果表明:用0.6,1.2,2.4 mmol/L的ACAC处理MAC-T后,细胞凋亡率呈剂量依赖性升高;凋亡相关基因Bcl2表达下调,Bax、Caspase9、Caspase3表达上调;UPR的下游基因GRP78、ATF4和XBP1s表达上调。用TUDCA预处理后,缓解了ACAC导致的MAC-T凋亡相关基因和UPR下游基因表达的变化及细胞凋亡率升高。说明高浓度的ACAC通过UPR导致奶牛乳腺上皮细胞凋亡。

未折叠蛋白应答通路与疾病

在真核细胞内质网中未折叠蛋白聚集时,细胞为生存启动未折叠蛋白应答(UPR),但UPR时间过长可诱发细胞凋亡等一系列生物学效应。近来发现,UPR与很多疾病的发生、发展密切相关,常见的有神经系统变性疾病、糖尿病、肿瘤及脊柱关节病等。本文主要就近年来研究较为深入的未折叠蛋白应答通路与疾病的关系作一简要介绍。

坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应

【目的】检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路(PERK、IRE1和ATF6),为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础。【方法】取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒(JS804株),于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个组织样品总RNA,反转录获得cDNA。根据未折叠蛋白反应的3条信号通路,选取不同通路中的标志性分子,设计合成特异性引物,利用荧光定量PCR方法检测靶基因。以GAPDH为内参基因,采用相对定量法(2-ΔΔCt),分析靶基因的表达水平。【结果】雏鸭肝脏中坦布苏病毒含量最高,心脏次之,脑最低。对未折叠蛋白反应标志性分子GRP78的检测结果显示,脑和肝脏中GRP78表达量持续升高,并在攻毒后36 h达到顶峰(4.21倍和10.14倍),心脏中GRP78表达量仅在攻毒后36 h短暂升高(1.32倍)。PERK信号通路标志性分子ATF4表达水平在肝脏和脑中分别从攻毒后24 h和36 h持续升高至攻毒后48 h,并在攻毒后36 h达到顶峰(2.71倍和6.02倍),心脏中ATF4的表达量则仅在攻毒后36 h时升高(1.57倍)。IRE1信号通路标志性分子XBP1s在肝脏中的表达量升高最为显著(9倍),而脑中EDEM的表达量升高最为显著(3.87倍)且持续时间最长(从攻毒后12 h至攻毒后48 h)。与对照组相比,ATF6信号通路标志性分子GRP94和XBP1u均出现升高现象,虽然两种蛋白在不同组织中表达量变化的时间点和趋势不同,但均在攻毒后36 h出现峰值。【结论】首次报道了坦布苏病毒感染可在雏鸭体内激活未折叠蛋白反应的3条信号通路,本研究将有助于深入研究坦布苏病毒与宿主之间的相互作用机制。

未折叠蛋白反应在肝癌中的作用研究进展

内质网(ER)是交织分布于哺乳动物真核细胞内的一个膜的管道系统。各种生理和病理因素均可引发内质网应激(ERS)使细胞受损伤。由于ERS时ER内的未折叠蛋白和错误折叠蛋白增多,使ER功能紊乱,从而引发了未折叠蛋白反应(UPR),保护由内质网应激引起的细胞损伤,恢复细胞的正常功能。本文介绍了UPR的发生、发展机制,综述了国内外对UPR和肝癌的最新研究进展。

Hsp90抑制剂对未折叠蛋白反应作用的研究进展

肿瘤细胞因癌基因突变、缺氧及营养受限而高度依赖未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。细胞通过内质网(endoplasmic reticulum,ER)膜上3个跨膜蛋白感知未折叠蛋白信号,引起未折叠蛋白反应,动态调控内质网折叠能力,一方面通过暂时减缓翻译和加快蛋白质流出减少ER蛋白质折叠负担,另一方面通过转录因子提高伴侣分子合成,增加ER折叠能力。未折叠的蛋白质长时间积聚在ER会对细胞产生毒性,引起不能缓解的ER应激状态,启动细胞凋亡程序。热休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)是一种进化保守的伴侣分子,参与了300多种新生蛋白质的折叠与成熟,其中包括UPR重要信号IRE1α(inositol-requiring enzyme 1α)。Hsp90抑制剂导致细胞产生大量未折叠蛋白质,同时直接诱导IRE1α的降解,从而破坏UPR恢复蛋白质平衡的能力,诱导UPR相关凋亡。目前,Hsp90抑制剂可有效诱导分泌型肿瘤细胞如骨髓瘤以及RAS突变肿瘤UPR途径的凋亡。

未折叠蛋白反应-细胞蛋白质的传感器与调配器

内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)是负责折叠和加工大部分分泌的多肽,并在维持蛋白质动态平衡中起着重要的作用。蛋白质对于细胞健康和生存能力至关重要,当新合成的未折叠蛋白质异常积累和(或)发生错误折叠超过ER处理能力时,细胞内质网会通过未折叠蛋白质反应(Unfolded protein response,UPR)作为一组适应性信号传导途径降低蛋白质的合成,促进其折叠、运输和降解以恢复细胞内环境的稳定。

基于UPR通路IRE1、PERK、ATF6对脂肪组织的作用研究进展

应用文献资料,研究脂肪细胞分化与内质网应激对于代谢性相关疾病的影响作用及相关机制,为临床提供合理的用药原则,并为相关新药的研发提供一定的理论依据。作为蛋白质合成与能量代谢的重要场所,当内质网遭受到外界刺激时,内质网应激(ERS)将被触发,使内质网中错误及未折叠蛋白增加,加重内质网负荷,诱发未折叠蛋白反应(UPR)。UPR经过肌醇需求激酶-1(IRE1)、类PKR的内质网激酶(PERK)、转录激活因子6(ATF6)三条通路进行介导,进而缓解ERS。其中作为维持机体能量代谢平衡的脂肪细胞的相关分化与成熟同样受到ERS的影响。UPR的三条通路:IRE1α-XBP1通路、PERK-eIF2α-CHOP通路、ATF6-C/EBPβ-PPARγ通路均可不同程度地推动脂肪细胞的分化与成熟,加快米色与棕色脂肪的形成,增加热量产生,促进能量的消耗,减缓肥胖症的发生。三条通路在另一方面还可诱发炎症因子的表达,导致炎症反应。而持续的炎症反应将会进一步加重代谢疾病的恶化,进一步影响脂肪的正常分化。因此,根据UPR的三条通路对机体能量代谢影响的机制,为治疗与脂肪组织相关的代谢疾病提供合理治疗的新理念与新方法。

GO通过氧化损伤激活秀丽线虫未折叠蛋白反应

以秀丽线虫为受试生物,探讨氧化石墨烯(GO)对秀丽线虫未折叠蛋白应答的激活及其与氧化应激的关系。将L4幼虫暴露于GO中24h,通过检测活性氧(ROS)水平、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等指标评估GO对秀丽线虫所致氧化损伤;以hsp-4和hsp-6分别作为秀丽线虫内质网和线粒体未折叠蛋白反应(UPR)的报告基因评价GO对秀丽线虫UPR应答的激活;同时以谷胱甘肽(GSH)作为抗氧化剂探讨GO所致UPR应答与氧化应激的关系。研究结果显示,GO暴露后秀丽线虫体内ROS、LDH和MDA水平升高,抗氧化酶活性上升;内质网和线粒体UPR反应增强,GSH预处理可以降低内质网和线粒体UPR应答。研究表明,GO短期暴露可以诱导秀丽线虫机体氧化应激进而激活UPR应答,抗氧化保护可以降低UPR应答反应。

PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元死亡中作用

目的 探讨PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法 利用小鼠原代培养成纤维细胞,应用Western blot和免疫荧光染色法,观察内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin)对PERK通路的激活,利用小鼠原代培养中脑多巴胺能神经元,应用TH免疫荧光染色法对存活的中脑多巴胺能神经元进行计数,以观察PERK抑制剂GSK2606414对长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡的影响。结果 在Thapsigargin处理后的原代成纤维细胞中p-PERK、p-eIF2α、ATF4水平均显著升高,Thapsigargin诱导中脑多巴胺能神经元死亡,PERK抑制剂GSK2606414可显著减少长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡。结论 内质网应激激活PERK通路;长时程内质网应激导致中脑多巴胺能神经元死亡,抑制PERK通路的激活可以缓解长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元死亡,PERK通路参与了长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元变性死亡。

原发性干燥综合征与未折叠蛋白反应

原发性干燥综合征(primary sj gren′s syndrome,pSS)是一种主要侵犯外分泌腺的慢性自身免疫性疾病,治疗方法多为经验性用药,缺乏循证医学的证据。有研究认为pSS本质上就是一种上皮细胞炎,唾液腺上皮细胞(salivary gland epithelial cells,SGECs)在pSS中起着重要的致病作用,它是内质网伸展最广的细胞之一,当细胞受损或处于压力条件下时,便会诱发内质网应激,蛋白质错误折叠率和未折叠率增高,细胞为恢复正常的生理功能,保持内质网的稳态,便会激活相关凋亡通路,诱导细胞凋亡,产生未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。UPR通常会激活3条信号通路:PERK、IRE1和ATF6,以帮助内质网蛋白质的正确折叠,使内质网功能在应激的早期处于一个正常生理平衡状态。当内质网长期、连续应激时,便会激活多条凋亡信号,持续的凋亡会引起细胞的死亡和代谢紊乱,造成严重的损伤。

胶质瘤与未折叠蛋白反应

内质网(ER)是细胞内重要的细胞器,具有修饰、折叠和分泌新合成蛋白质的功能。 当多种因素影响了蛋白质的折叠能力,将导致未折叠蛋白质堆积在内质网腔中,从而诱发内质网应激(ERS),并激活未折叠蛋白反应(UPR)。 UPR 是内质网中的一种反馈调控系统,能通过调节内质网中错误折叠或未折叠蛋白,维持内质网稳态。 近年来,许多研究发现 UPR 与胶质瘤的发生与进展有着千丝万缕的联系。 通过将 UPR 作为靶点,研发相关药物治疗胶质瘤已经是现在研究的一个热点,也是人类研究胶质瘤治疗的一个新方向。 文章将综述 UPR 在胶质瘤中的研究进展。

着丝粒蛋白F mRNA在肺腺癌细胞系、肺腺癌组织中的表达变化及相关调控信号通路分析

目的观察着丝粒蛋白F(CENPF) mRNA在肺腺癌细胞系中的表达变化,分析CENPF mRNA在肺腺癌组织中的表达变化并探讨其相关调控信号通路。方法①采用实时定量PCR法检测肺正常上皮细胞系BEAS-2B、肺腺癌细胞系(A549、NCI-H1650、NCI-H23、NCI-H1975) CENPF mRNA。②采用癌症基因组图谱(TCGA)的肺腺癌数据集分析CENPF mRNA表达与肺腺癌临床病理参数、预后的关系,Cox回归模型分析肺腺癌患者预后的影响因素。③采用基因集富集分析(GSEA)法分析受CENPF调控的肺腺癌相关信号通路。结果①A549、NCI-H1650、NCI-H23、NCI-H1975、BEAS-2B细胞CENPF mRNA相对表达量分别为4. 333±0. 271、3. 193±0. 188、2. 770±0. 091、5. 491±0. 249、1. 006±0. 071,A549、NCI-H1650、NCI-H23、NCI-H1975细胞CENPF mRNA相对表达量均高于BEAS-2B(P均<0. 05)。②肺腺癌、癌旁正常组织CENPF mRNA的相对表达量分别为9. 632±0. 059、6. 472±0. 093,二者比较,P <0. 001。CENPF mRNA表达与肺腺癌患者的性别、年龄、T分期、N分期及TNM分期相关(P均<0. 05)。生存分析结果显示,与CENPF mRNA低表达患者比较,CENPF mRNA高表达的肺腺癌患者的预后差(P=0. 001)。CENPF mRNA表达、临床TNM分期(HR分别为1. 667,1. 414; P均<0. 01)是影响肺腺癌患者预后的因素。③与CENPF mRNA高表达有关的肺腺癌调控信号通路有G2M检查点(P <0. 001,FDR <0. 001)、有丝分裂纺锤体(P <0. 001,FDR <0. 001)、E2F靶基因(P <0. 001,FDR <0. 001)、MYC靶基因(P <0. 001,FDR=0. 001)、m TOR信号通路(P=0. 002,FDR=0. 005)、精子形成(P=0. 002,FDR=0. 009)、未折叠蛋白反应(P=0. 002,FDR=0. 020)及PI3K/Akt/m TOR信号通路(P=0. 015,FDR=0. 117)等。结论肺腺癌组织及细胞系中存在CENPF高表达,CENPF高表达与肺腺癌患者的恶性病理特征及不良预后密切相关。CENPF mRNA高表达是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素。CENPF可能通过调节G2M检查点、有丝分裂纺锤体、E2F靶基因、MYC靶基因、m TOR信号通路、精子形成、未折叠蛋白反应及PI3K/Akt/m TOR信号通路在肺腺癌的发生、发展中起重要作用。

未折叠蛋白反应-蛋白激酶R样内质网激酶通路对氧化应激诱导生长抑制因子1的影响

目的寻找肝脏内质网应激过程中未折叠蛋白反应-蛋白激酶R样内质网激酶(UPR-PERK)通路潜在的作用靶点,并在肝脏内质网应激模型中验证UPR-PERK通路对氧化应激诱导生长抑制因子1(Osgin1)是否存在调控关系。方法以GEO数据库作为分析数据的来源,通过GEO2R软件挑选出符合标准的差异基因,对禁食-再喂食、运动及年龄3种生理因素引起显著变化的差异基因使用韦恩图取交集,确定Osgin1是变化显著的基因。通过GENEMANIA数据库验证UPR-PERK通路与Osgin1是否存在直接作用。随后分别在GEO数据库和TCGA数据库中通过3种不同的肝脏内质网应激模型(急性内质网应激模型、非酒精性脂肪性肝病模型及肝癌模型)进一步验证UPR-PERK通路对于Osgin1的调控关系。数据统计采用GraphPadPrism 9.0.0软件,采用Pearson相关分析法分析UPR-PERK通路基因与Osgin1转录水平的相关性。结果与对照组相比,在禁食-再喂食、增加运动及增龄3种生理因素下,Osgin1转录水平分别上调了700%、下调156%以及229%(P<0.05)。经GENEMANIA数据库验证UPR-PERK通路与Osgin1存在直接作用。在内质网应激诱导剂导致的急性肝脏内质网应激模型中,与对照组相比,抑制UPR-PERK通路相关基因(Eif2ak3)可以显著逆转由内质网应激诱导剂Tunicamycin导致的Osgin1 mRNA水平的上调(Osgin1 mRNA下调87%,P<0.001);在非酒精性脂肪性肝病模型中,与对照组相比,通过给予药物实现缓解UPR-PERK通路的同时,Osgin1转录水平也随之下调(减重药物BI4556906组Osgin1 mRNA下调48.0%;EX10970组Osgin1 mRNA下调43.3%;肌醇需要酶1α激动剂IXA4组Osgin1 mRNA下调56.6%;P<0.05);在肝癌模型中,与对照组相比,UPR-PERK通路相关基因与Osgin1转录水平在肝癌组织中显著上调(Osgin1 mRNA上调109%,P<0.001)。结论在生理条件及肝脏内质网应激模型中,UPR-PERK通路的激活上调Osgin1转录水平。

未折叠蛋白反应在急性呼吸窘迫综合征中的研究进展

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是儿童的严重呼吸系统疾病,发病机制尚未完全明确,主要与各种肺损伤机制如炎症反应、自噬等有关。近年来研究发现,内质网应激可加重ARDS肺部损伤,其中蛋白质稳态失衡可诱发激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。UPR可通过介导跨膜蛋白相关的信号通路来重建内质网的内稳态,而持续过度的内质网应激将促进细胞凋亡和自噬的发生。该文就UPR在ARDS肺损伤相关的信号通路以及炎性效应等方面的研究进展作一综述。

线粒体未折叠蛋白反应信号转导通路研究进展

线粒体未折叠蛋白反应是线粒体蛋白质质量控制程序的重要组成部分,在应激状态下可有效清除未折叠蛋白或错误折叠蛋白,维持线粒体池的稳定健康。线粒体未折叠蛋白反应由多条信号转导通路协调控制:经典的ATF4/ATF5-CHOP途径受线粒体基质中的未折叠蛋白或错误折叠蛋白积累诱发,通过调控分子伴侣和蛋白酶减轻应激毒性;Sirt3-FOXO3a-SOD2途径定位在线粒体基质中,在抗氧化损伤方面作用突出;ERα-NRF1-HTRA2途径主要清除线粒体膜间隙中的未折叠蛋白,提高线粒体蛋白质质量控制能力。这三条信号转导通路彼此独立,又存在交互作用,在机体应激状态下共同激发线粒体最大限度的适应能力,维护机体健康。

内质网应激PERK通路在肿瘤中的研究进展

肿瘤细胞在生长、浸润和转移过程中经历的缺氧、低糖等多种环境压力会对肿瘤细胞造成内质网应激,为应对内质网应激,肿瘤细胞会诱发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)。PERK通路作为激活UPR的一条关键通路可通过提高肿瘤对不良微环境的耐受程度、诱导新生血管生成、诱导自噬体形成、激活凋亡信号分子等促进肿瘤细胞生长、增殖、侵袭及保护性自噬,并且在UPR达到一定程度时诱导肿瘤细胞凋亡及自噬性死亡。

新型内质网应激诱导蛋白TRIM25在乳腺癌细胞中的作用研究

内质网应激是当细胞受到缺氧或营养剥夺等外界因素刺激时而产生的一种效应,该效应与肿瘤细胞的存活息息相关。该研究揭示了TRIM25作为一种新型内质网应激诱导蛋白在肿瘤细胞中所发挥的作用,可为发现新的肿瘤靶点提供重要依据。该文以乳腺癌细胞MCF7为对象,先筛选构建了稳定敲低TRIM25的MCF7细胞系;然后,检测了TRIM25敲低对内质网应激、未折叠蛋白反应信号通路和内质网应激诱导的细胞凋亡的影响,以及TRIM25在不同乳腺细胞中的表达;最后,通过生物信息学分析TRIM25表达量与乳腺癌患者预后的相关性。结果显示,内质网应激会诱导TRIM25表达水平的大幅上升。通过敲低TRIM25可诱导内质网应激、激活未折叠蛋白反应信号通路从而显著促进乳腺癌细胞MCF7的凋亡。研究还发现,乳腺原发上皮细胞转化为乳腺癌细胞过程中伴随有TRIM25蛋白水平的上调,生物信息学分析也显示TRIM25在乳腺癌组织中高表达,并提示乳腺癌患者预后不良。