一种新的末端转移酶活力测定法——荧光底物掺入法

本文介绍了一种末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)活力的荧光底物掺入测定法。本法基于合成一种荧光物质εdATP(1,N-ethenodeoxyadenosine triphosphate)以代替放射性标记底物,在含εdATP与oligo(dA)_(25)的反应体系中,使TdT催化εdATP加接至oligo(dA)_(25)的3’-OH末端可得聚合产物,经分离、酶解后,测定游离εdATP的荧光强度并根据εdATP的掺入量测定TdT活力。方法简便、灵敏,测定范围较宽、重现性好及无需放射性底物。适用于临床定量检测白血病患者白细胞中TdT酶活力及基因工程中TdT工具酶活力的测定。

反义寡核苷酸作用后肝癌细胞端粒酶活性的变化及差异蛋白的表达

目的利用针对端粒酶RNA的反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(NODN)作用于人肝癌细胞SMMC-7721,比较ASODN和NODN作用后癌细胞端粒酶活性及相关蛋白的变化。方法利用实时荧光定量端粒重复序列扩增法(FQ-TRAP法),检测ASODN和NODN作用后肿瘤细胞端粒酶活性变化;蛋白质芯片-飞行时间质谱仪,检测ASODN和NODN作用后特异蛋白质的变化。对照组为未加任何处理因素的SMMC-7721细胞。结果FQ-TRAP法检测CT值,A-SODN组为35.2±2.3,NODN组为26.1±3.5,对照组为18.2±0.7。蛋白质芯片-飞行时间质谱仪检测发现,ASODN组有19个差异蛋白分子高表达,13个差异蛋白分子低表达。NODN组有20个差异蛋白分子高表达,12个差异蛋白分子低表达。所有差异蛋白的分子量分布在3 000 D^10 000 D之间。结论ASODN和NODN均能抑制肝癌细胞端粒酶活性,两者作用SMMC-7721细胞后所表达的差异蛋白十分相似。

奈韦拉平对HeLa细胞端粒酶活性和细胞周期的影响

目的:研究奈韦拉平(nevirapine,NVP)对HeLa细胞端粒酶活性和细胞周期的影响。方法:采用TRAP-PCR-ELISA方法检测HeLa细胞在奈韦拉平作用后端粒酶活性的变化,用流式细胞仪分析细胞周期的改变。结果:NVP作用后,HeLa细胞端粒酶活性明显抑制(P<0.05),并且HeLa细胞的G2/M期细胞含量明显增高(P<0.01)。结论:NVP对肿瘤细胞的端粒酶活性有抑制作用。

高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中端粒酶逆转录酶的表达变化

目的研究高氧诱导视网膜新生血管模型中小鼠端粒酶逆转录酶（TERT）基因表达水平是否有变化，为进一步研究视网膜新生血管疾病的预防和治疗提供新的靶点。方法实验研究。选取7d龄C57BL/6J新生小鼠32只，分高氧组和对照组，每组16只。高氧组小鼠以密闭氧箱内以75％±2％氧浓度饲养5d后置于正常氧浓度环境中，正常对照组小鼠于正常氧环境中饲养。于小鼠生后12、14及19d时分别取高氧组和对照组小鼠各2只（4只眼），经尾静脉行2％伊文思蓝溶液灌注并做视网膜铺片，荧光显微镜下观察视网膜新生血管的形成情况。高氧模型组和正常对照组生后19d幼鼠3只，行HE染色，光学显微镜下观察视网膜血管形态，观察突破内界膜的内皮细胞核数。取生后19d高氧组和对照组小鼠，分别取其视网膜组织并提取总RNA，反转录成cDNA后行反转录PCR，2％琼脂糖凝胶电泳并照相。提取视网膜总RNA，反转录成cDNA后（同RT-PCR），配制荧光定量实时PCR反应体系（总计20μl），在60℃检测荧光信号，分析图像。分别取高氧模型组和正常对照组P19小鼠行眼球切片，常规处理后TERT抗体孵育37℃60min，HRP酶标二抗孵育30min，DAB显色，中性胶封片，镜下观察并照相。结果高氧诱导模型小鼠生后12d眼底后极部出现大片无灌注区，生后14d眼底后极部出现新生血管迂曲、渗漏等视网膜血管病变。生后17—19d视网膜新生血管形成达到高峰。正常小鼠视网膜组织切片HE染色基本看不到突出内界膜的血管芽及血管管腔，内界膜下视网膜内的血管内皮细胞核散在分布、数量较少；高氧组见大量突出内界膜伸向玻璃体腔的血管管腔及血管芽，内界膜下视网膜内也有大量血管内皮细胞增生。19d高氧模型组小鼠视网膜TERT及bFGFmRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显提高，二者差异有统计学意义（F=8．575，5．667；P〈0．05）。生后19d实时PCR检测高氧模型组小鼠视网膜TERTmRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显上调，差异有统计学意义（F=173．104，P〈0．05）。生后19d高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中视网膜新生血管TERT表达阳性，同日龄对照组新生小鼠视网膜血管TERT表达阴性。结论高氧诱导视网膜新生血管小鼠模型中端粒酶逆转录酶和新生血管形成相关因子表达水平明显上调，可能会成为视网膜新生血管疾病预防和治疗的新靶点。

转导hTERT基因致人骨髓基质细胞永生化及向神经元样细胞诱导分化的研究

目的建立永生化的人骨髓基质细胞(hMSC)系,以供神经外科临床和基础研究使用。方法原代培养人骨髓基质细胞,采用含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的逆转录病毒载体上清感染hMSC,经筛选得到阳性克隆,在体外进行连续培养。应用PCR、逆转录PCR(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测hTERT基因的整合及表达情况,并用10%β-巯基乙醇(β-ME)、反式维甲酸(RA)、Forskolin和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对转化后的hMSC-hTERT细胞进行诱导,使其向神经元样细胞分化。结果外源性hTERT基因在DNA、RNA和蛋白质水平均有表达,诱导后的hMSC-hTERT细胞表达神经元特异性标志物神经核蛋白(NeuN)和βⅢ微管蛋白(Tubulin-βⅢ)。hMSC-hTERT细胞至今已传至82代。结论外源hTERT基因在hMSC细胞中稳定整合并表达,永生化的hMSC细胞系成功建立;在一定诱导条件下,永生化的hMSC细胞能够在体外分化成神经元样细胞。

编码反义人端粒酶RNA组分重组逆转录病毒载体的构建

目的:构建编码反义人端粒酶RNA组分的重组逆转录病毒载体,以用于肿瘤的基因治疗。方法:用PCR方法获得目的基因-人端粒酶RNA组分(hTERC),酶切分析及DNA测序进行鉴定,用T4连接酶连接酶切产物,PCR以及EcoR1和BamH1双酶切鉴定重组逆转录病毒载体。结果:hTERC大小为490bp。DNA测序表明,pMD-hTERC中插入的hTERC与NCBI上的序列进行比对,同源性达到99%。重组逆转录病毒载体PLXSN-hTERC经EcoR1和BamH1双酶切后,可见到大小分别为5900bp和500bp的两条带。结论:编码反义人端粒酶RNA组分的重组逆转录病毒载体已构建成功,是一个很有前景的抗肿瘤治疗策略。

TERT基因siRNA抑制鼠视网膜新生血管形成的研究

目的探讨小鼠端粒酶逆转录酶（TERT）小分子干扰RNA（siRNA）对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用，及其用于视网膜新生血管疾病治疗的可行性。方法构建TERTsiRNA重组质粒pSIREN—mTERT－1和阴性对照质粒pSIREN—mTERT—N。选择7d龄C57BL／6J小鼠80只随机分为基因治疗组、阴性质粒组、高氧对照组及正常对照组，每组20只。前3组置于75％±2％高氧环境中生活5d，然后回到正常氧环境中。于第12天出氧舱时，分别向基因治疗组、阴性质粒组两组小鼠玻璃体腔内注射上述两种质粒。正常对照组小鼠正常氧环境中饲养。高氧对照组和正常对照组不予玻璃体腔注射。第19天用2％Evens蓝灌注进行视网膜铺片，观察各组小鼠视网膜血管形态变化；反转录－PCR及Real—timePCR检测各组间TERTmRNA和新生血管相关基因的表达变化；组织切片观察并计数突破内界膜的血管内皮细胞数量。对数据采用单因素方差分析进行统计学比较。结果荧光造影视网膜铺片显示，基因治疗组整个视网膜血管分布网基本正常，走形较自然，基本接近正常对照组，未见明显的新生血管丛及大片荧光渗漏，只在视网膜中周部及周边部见少许荧光渗漏，但较阴性质粒组及高氧对照组明显减少。阴性质粒组及高氧对照组视网膜血管紊乱，中周部血管迂曲，伴大片荧光渗漏。RT—PCR及实时PCR显示基因治疗组小鼠视网膜TERTmRNA表达为0．56±0．32，明显少于阴性质粒组及高氧对照组（P〈0．05）。组织切片HE染色观察，基因治疗组仅见1处新生血管芽，偶见突出内界膜的细胞核；阴性质粒组及高氧对照组见散在突出内界膜伸向玻璃体腔的血管芽，内界膜下出现明显的血管内皮细胞增生；光镜下观察突破内界膜新生血管内皮细胞计数，基因治疗组（14．62±1．70）较阴性质粒组（32．38±7．50）及高氧对照组明显减少，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论TERT特异的siRNA能有效地抑视网膜新生血管动物模型视网膜中视网膜新生血管的形成，可能会成为一种治疗视网膜新生血管疾病的新方法。

盘状红斑狼疮口腔粘膜组织中上皮细胞凋亡的初步研究

目的 观察了盘状红斑狼疮 (DLE)病变粘膜组织中上皮细胞凋亡和增殖的情况并分析其可能的病理学意义。方法 本实验应用原位末端转移酶标记技术 (TUNEL)检测DLE粘膜组织中上皮细胞的凋亡情况和ABC免疫组化技术检测细胞的增殖情况。结果 病变组与对照组相比 ,DLE病变上皮基底层区凋亡阳性细胞较多 ,而PCNA阳性反应较弱 ;粘膜病组织固有层中的部分炎细胞和血管内皮细胞也有阳性凋亡信号 ,推测该处局部组织的免疫防御能力可能有所下降。结论 基底细胞的凋亡对DLE病变的发生。