得克萨斯红末端修饰单链DNA探针微阵列ZrO_2陶瓷小珠的发光特性研究

以N ( 4 马来酰亚胺氧化丁酰 ) 琥珀酰亚胺磺酸钠盐 (Sulfo GMBS)为偶链剂将 5 NH2 /3 Tex双末端修饰DNA探针偶链到 3 0 0 μmZrO2 陶瓷小珠表面上 ,制成了发红光的陶瓷小珠 .理论研究表明 ,小珠表面上 2 0 mer单链DNA探针之间的分子间距和微阵列密度是偶链反应溶液中DNA探针浓度、小珠数目和小珠大小的函数 .在优化条件下 ,2 0 mer单链DNA探针在小珠表面微阵列的最小分子间距约为 8 0nm ,因而在一个 3 0 0 μmZrO2 陶瓷小珠表面有10 10 数量级的 2 0 mer单链DNA探针进行微阵列 .

以“末端修饰法”构建人基因组的酵母人工染色体克隆

采用“末端修饰法”修饰酵母人工染色体（YAC）载体与基因组插入片段的酶切末端，并优化各个实验参数，成功地得到了4000多个YAC片段的克隆群，转化率为400～500转化子／μgDNA。经随机抽样初步鉴定：80％的阳性克隆能检出人工染色体，插入片段的大小范围为150～750kb，平均为450kb。载体连接实验检测表明，末端修饰法能有效防止“共连接”的发生。

末端修饰透明质酸聚合物胶束的制备及表征

目的通过修饰透明质酸(hyaluronic acid,HA)末端合成透明质酸-十八烯共聚物(hyaluronic acid-octadecene,HOY),并包载多柔比星制备聚合物胶束,考察其体外制剂学性质。方法合成末端巯基化的透明质酸(HA-SH),然后通过麦克尔加成反应与1-十八烯链接;超声法制备载药聚合物胶束,研究其粒径、电位、包封率、载药量及体外释放等性质。结果成功合成透明质酸-十八烯共聚物,其载药胶束的平均粒径为(237.2±2.7)nm,电位值为(-22.37±0.38)m V,包封率为(89.8±0.011)%,载药量为(5.4±0.007)%,体外释放研究表明,48 h时药物的累计释放率接近70%,具有明显的缓释作用。结论该实验制备了基于末端修饰透明质酸的聚合物胶束,为后续透明质酸给药系统的研究提供了参考。

大肠杆菌N~α-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原N末端乙酰化修饰的影响

目的:研究大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原(ProTα)N末端乙酰化修饰的影响。方法:在大肠杆菌中共表达ProTα与大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI,同时设置只表达ProTα的对照菌,分别提取纯化ProTα,利用HPLC检测其发生乙酰化修饰的程度。结果:ProTα的乙酰化修饰发生在翻译后水平,有无RimI的过表达、诱导时间的长短以及这两个因素之间的交叉效应均对ProTα的乙酰化程度有影响,其F值分别为53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;无论有无RimI过表达,乙酰化的ProTα所占比例在诱导6 h后逐渐升高(P<0.0001);在过表达Ri-mI的菌株中,乙酰化的ProTα在诱导12 h后占37.4%,而在无RimI过表达的菌株中占64.3%;RimI对ProTα乙酰化的抑制作用从诱导6 h后开始显现(P=0.0007)。结论:在大肠杆菌中,过量的Nα-乙酰基转移酶RimI可抑制人胸腺素α原的乙酰化修饰。

HLA-DRB1-12寡核苷酸芯片的制备及优化(英文)

生物芯片技术是基于杂交原理发展而来的 ,是将固相反应的原理和形式应用于大分子识别反应 (核酸杂交、抗原抗体结合或酶促的模板依赖性的连接、延伸等反应 )中 ,以达到对大量的目标分子进行快速、平行的特异识别。寡核苷酸芯片的制备过程中关键部分是基片的表面化学处理和探针末端的不同修饰。为了比较不同末端修饰探针在不同化学处理的载玻片上的杂交信号的强弱 ,本研究根据HLA DRB1 12的序列设计 8种不同类型的探针 ,即 4种 5′末端修饰探针 ,包括末端氨基修饰探针 (N) ,氨基加四聚乙二醇间隔臂探针 (NL) ,硫代探针 (S) ,硫代加四聚乙二醇间隔臂探针 (SL)和 4种 3′末端修饰探针 ,同样包括末端氨基修饰探针 ,氨基加四聚乙二醇间隔臂探针 ,硫代探针 ,硫代加四聚乙二醇间隔臂探针。将这 8种探针分别固定在溴化芯片和醛基芯片上 ,与末端标记荧光的不对称的PCR产物进行杂交 ,通过比较杂交结果荧光信号的强弱 ,筛选出探针同活化基片的最佳组合 ,从而达到优化寡核苷酸芯片制备的目的。另外 ,为了进一步比较四聚乙二醇间隔臂对杂交信号的影响 ,设计末端连接不同数目四聚乙二醇的 3′氨基探针。结果显示 ,3′末端修饰探针杂交信号强于 5′末端修饰探针 。

组蛋白赖氨酸甲基化的表观遗传图

组蛋白N末端有多种翻译后修饰,包括乙酰化,磷酸化,甲基化,泛素化和ADP-ribosylation,上述修饰酶以及选择性结合到位置特异性修饰组蛋白的染色质相关蛋白的发现揭示组蛋白末端修饰能明显扩大遗传密码的信息容量,另外它们显示还能为染色质区域充当很好的检索工具,促进表观遗传控制以及染色体的功能组织.

概述基因工程中的工具酶

催化特异性反应的工具酶在基因工程中发挥着重要的作用,根据其催化反应特性可分为限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和末端修饰酶4种类型。对这四种工具酶的发现和作用机制进行概述,并展望工具酶的应用前景。

生物模拟转氨反应在蛋白质修饰中的应用

作为化学生物学研究的重要方向,生物正交反应的发展与应用为生命科学研究提供了有力武器.利用生物正交反应,人们可以将合成分子与目标天然大分子在特定位点上实现特异性连接,进而达成诸如标记、定位、功能化、固定等一系列目标.生物模拟转氨反应及其衍生反应是一类特异性蛋白质N端修饰的生物正交反应,与天然蛋白侧链、C端的连接反应相互补充.由于该反应具有高效性、通用性、温和性及不需要引入突变或非天然氨基酸等优点,从发现以来已较为广泛地运用于蛋白质化学生物学的多个相关领域.在介绍其基本原理及反应优化的基础上,综述该类反应的发展及应用情况.

末端蛋白质组学研究进展

蛋白质是一类重要的生物大分子,参与生物体的各种生命活动。蛋白质组学研究主要致力于从整体水平上对一个生物体包含的所有蛋白质进行定性和定量分析。蛋白质的末端参与众多的生物学过程,与蛋白质的转运、定位、凋亡和降解等有密切联系。因此,详细研究末端蛋白质组学将有助于揭示相关的生物学机制,是蛋白质组学研究的重点之一。本文就蛋白质末端的修饰、功能、研究方法及应用前景进行简要综述。

蛋白质化学修饰的研究进展

蛋白质是生命的物质基础,其特定的空间结构决定了蛋白质的功能。用化学修饰的方法改变蛋白质结构和功能一直是蛋白质工程改造方面研究的热点。在越来越多的研究报道中,不仅有利用一系列酶对翻译后的蛋白质进行修饰的方法,还有利用小分子物质缀合的修饰方法。该文在分析和总结现有相关文献的基础上,综述了蛋白质末端修饰、侧链上的巯基修饰、二硫键修饰及磷酸化修饰的方法。

重组细胞色素酶P450 3A4表达和鉴定

细胞色素酶P450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶P450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYP3A4蛋白。用逆转录-聚合酶链反应方法从人肝脏总RNA中得到CYP3A4的cDNA,然后直接插入pMD20-T Vector中,将测序正确的N-末端和C-末端进行修饰。然后利用双酶切插入到表达载体pET-28a-c(+)Vectors,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。并通过定点突变的方法获得CYP3A4亚型P467S(CYP3A4*19)。采用SPSS13.0设计4因素2水平正交实验,对α-ALA(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、IPTG(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、卡那霉素(50μg/mL和100μg/mL)添加浓度及菌的接种密度(接种1%和接种2%)进行优化。并用SPSS13.0对结果进行分析,选择出比较好的组合进行下一步的大规模的诱导表达。经定点突变的方法成功获得了CYP3A4*19亚型。经IPTG诱导获得CYP3A4蛋白,并通过Western blot验证。用BCA蛋白浓度定量分析试剂盒测定的膜蛋白浓度在65μg/mL左右,α-ALA、抗生素(卡那霉素)、T7启动子诱导剂IPTG及接种密度高低两水平中对膜蛋白的表达水平的影响没有统计学意义。

成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析

目的:采用成像毛细管等点聚焦电泳法分析单克隆抗体制品的电荷异质性。方法:应用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,对2种单克隆抗体制品酶切处理前后进行电荷异质性分析。结果:羧肽酶B处理前后的抗体1成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性引起;羧肽酶B处理和/或N-糖苷酶处理前后的抗体2成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性和N-糖的唾液酸修饰引起。结论:采用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,可较好地分析单克隆抗体产品的电荷异质性;并且配合合适的酶切处理,可判断单克隆抗体产品主要电荷异质性的来源,为保证单克隆抗体产品技术药物生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。