山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。

嵌合Neomycin基因的腺相关病毒末端反向重复顺序(ITRs)折叠结构在真核细胞染色体基因组上的整合作用研究

腺相关病毒(AAV,Adeno associated Virus)是一类线状单股DNA的微小病毒。腺相关病毒因共具有定点整合(19q13 qter)及非病原性等特点而在基因转移与治疗中可望作为较为理想的载体。其在宿主染色体DNA上的整合需要辅助病毒共转染。根据Cavalier-Smith的线状SS DNA分子复制模式,即复制过程中3′OH端作为引物在DNA聚合酶的作用下合成另一姊妹股DNA分子,然后共价地连接到亲代未折叠的5′端回纹末端而进行DNA复制。

腺病毒反向重复序列ITRs的人工合成与克隆

为获得高GC含量(72%)的腺伴随病毒AAV反向末端重复序列ITRs(178 bp),以自行设计的4段寡核苷酸引物(约59 bp)为模板,采用融合PCR方法将其人工合成。回收目的片段后,通过TA克隆、PCR和酶切鉴定获得8个阳性转化子。经测序鉴定,得到了5个序列完全正确的克隆。本实验为研究含有ITRs的重组杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达持续时间的影响奠定了基础。

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。

一种基于ITR序列的羊痘病毒TaqMan探针荧光PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测羊痘病毒的方法,试验根据羊痘病毒[绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)]末端反向重复(ITR)序列的保守区设计了1对特异引物和TaqMan探针,通过优化反应体系建立了一种检测羊痘病毒的TaqMan探针荧光PCR检测方法。结果表明:该方法对羊痘病毒具有良好的特异性,不与猪痘病毒(SWPV)、鸡痘病毒(FPV)、羊传染性脓疱皮炎病毒(ORFV)及口蹄疫病毒(FMDV)发生交叉反应。该方法对质粒标准对照(PCR^2.1-GPTV-ITR)的最适线性检测范围为2.3×10~1~2.3×10~8拷贝/μL,标准曲线方程为Y=-3.416 2X+38.605,相关系数(R^2)为0.999 9,检测下限为23拷贝数。对3个不同浓度的PCR^2.1-GPTV-ITR进行组内试验和组间试验检测,每个浓度的重复试验Ct值的变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对来自安徽、广西和天津地区的36份临床样本进行羊痘病毒检测,其中18份样本羊痘病毒核酸检测为阳性。说明本方法可用于羊痘病毒快速、准确检测。

基于AAV-ITR的基因表达微载体

常用的基因治疗表达载体有病毒表达载体和质粒表达载体,这两类传统基因治疗载体含有大量病毒或细菌DNA序列,会引发人体较严重的免疫反应、细胞炎症、细胞毒性副作用、以及基因表达沉默化,是基因治疗应用于人类疾病治疗的一大障碍。项目构建了一种新型的、基于腺相关病毒(AAV)倒置末端重复序列(ITR)的基因表达单链微载体(AAV-ITR mini vector),并用GFP基因作为报告基因。通过热变性的方法制备单链DNA,然后将带有GFP的质粒、双链DNA载体、AAV-ITR基因表达微载体转入真核表达细胞,采用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测等较为简单的方法来检测其表达效率。实验结果显示,AAV-ITR基因表达微载体在293T细胞中具有较高的转染、表达效率,并且具有类似AAV病毒载体的特性。该研究结果将有助于进一步研发类似于AAV病毒载体的安全、无免疫原性的人造基因治疗载体。

AAV-ITR单链DNA微载体在小鼠骨骼肌中的表达

AAV-ITR单链DNA微载体是一种基于腺相关病毒(AAV)倒置末端重复序列(ITR)的基因表达载体(AAV-ITR ss DNA mini vector)。前期研究已证明AAV-ITR单链DNA微载体在HEK 293T细胞中具有较高的转染、表达效率。本文中将相同拷贝数的AAV-ITR单链DNA微载体、3?-ITR末端错配的AAV-ITR单链DNA微载体(AAV-ITRmm ss DNA mutant vector)、AAV-ITR双链DNA和质粒分别用Turbo Fect转入小鼠骨骼肌中,比较检测AAV-ITR单链DNA微载体与其他基因表达载体在小鼠体内1周、1个月及3个月的表达效率。组织切片经荧光显微镜观察及荧光灰度值分析表明,相同分子摩尔数的AAV-ITR单链DNA微载体比AAV-ITR双链DNA和质粒在不同时期表达效率都要高且更稳定。提取注射3个月后的肌肉组织的DNA,用荧光定量PCR分析比较各载体的存留分子数。RT-PCR的结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在注射3个月后的存留分子数较其他载体高。综合结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在动物体内具有表达效率高和长久稳定的优势,有可能开发为基因治疗的一种高效、稳定的新型载体。

多重数字PCR在rAAV基因组完整性评价中的探索应用

目的:探索采用多重数字PCR(dPCR)技术评价重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)基因组完整性的可行性。方法:采用芯片式dPCR系统,针对rAAV基因组的末端反向重复序列(ITR)区和目的基因(或3’非翻译区)建立双重PCR法,通过适量稀释使模板DNA在PCR芯片中呈理论单拷贝分布(阳性孔低于20%),单阳性孔代表非完整片段,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价rAAV基因组的完整性;尝试采用不同样品前处理方式(病毒基因组DNA、病毒颗粒、DNaseⅠ处理),并比较测试结果。结果:双重PCR测得拷贝数与单重PCR基本一致,无明显干扰;在一定范围内,样本的实测拷贝数与模板量呈线性相关,但单阳、双阳比例基本一致;提取的病毒基因组DNA实测拷贝数减少,但双阳率高于未处理病毒样本,DNaseⅠ处理后的病毒样本实测拷贝数明显减少,单阳、双阳比例与未处理病毒样本基本一致。结论:多重dPCR技术可用于评价rAAV产品基因组完整性,具有良好的应用前景。

测定重组腺相关病毒基因组滴度的qPCR新方法

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)在基因治疗应用中具有很多优势,但是其生物学滴度的测定仍很繁琐,不同实验室使用各自的方法和参照,这些都影响了重组腺相关病毒(rAAV)载体在临床前和临床上的应用。反向末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)是重组腺相关病毒载体中不可或缺的顺式作用元件,针对ITR2以及ITR2-CMV设计的qPCR检测方法可以快速、准确地得到rAAV2的基因组滴度,由于该方法可以广泛适用,因此对推动AAV滴度检测的标准化有重要意义。

EF1α启动的高效重组杆状病毒载体的构建及其表达效果

【目的】通过选用哺乳动物细胞特异性启动子—人类延伸因子1α启动子(Elonggation factor 1αpromoter,EF1-α)、利用病毒假型化工具—截断型水疱型口膜炎病毒G蛋白(Truncated Vessicular stomatitis virus protein G,VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs),来提高杆状病毒的转导效率及外源基因的表达水平。【方法】从pFB-VSV-GED-WPRE出发构建含EF1α启动子的2个重组杆状病毒转移载体pWK和pWK-ITR。再以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)基因为报告基因插入EF1α启动子的下游,构建重组转移载体pWK-eGFP和pWK-ITR-eGFP以及阴性对照pWK(-)-eGFP。将构建好的重组质粒转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,侵染少突神经胶质细胞(OL细胞)后,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】含有WPRE和ITRs的病毒BV-WK-eGFP、BVWK-ITR-eGFP荧光表达率明显高于阴性对照,且ITRs能够有效延长eGFP的表达时间,比对照组BV-WK(-)-eGFP延长了72 h。经VSV-GED假型化的杆状病毒BV-WK-eGFP、BV-WK-ITR-eGFP转导OL细胞的时间明显缩短,比阴性对照BV-WK(-)-eGFP减少了24 h,并且转导效率分别高出阴性对照25.7%与36.5%。【结论】实验证明了VSV-GED能够有效提高杆状病毒的转导效率,WPRE能够显著增强外源基因的表达效率,ITRs延长外源基因的表达时间。为探究改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的研发奠定了基础。

ITm活性转座子及其结构特征分析

ITm超家族是真核生物基因组中分布最广泛的DNA转座子家族之一,它们以DNA为媒介,通过"剪切–粘贴"机制在基因组中不断跳跃,引起基因组的重组与突变。随着对ITm转座子的深入研究,许多ITm转座子逐渐成为基因克隆、基因表达及其功能研究的重要工具。该文对活性ITm转座子作了较为全面的研究,并对其结构、拷贝数、分布以及转座特性进行了系统归纳,分析了活性ITm转座子螺旋–转角–螺旋(helix-turn-helix,HTH)结构,天冬氨酸–天冬氨酸–天冬氨酸/谷氨酸(Asp-Asp-Asp/Glu,DDD/E)催化结构域、Linker、核定位信号(nuclear localization sequence,NLS)及末端反向重复序列(terminal inverted repeats,TIRs)的序列特征。结果表明,自主转座活性的ITm转座子必须具备完整的转座酶及TIRs,上述结构及序列的突变均会不同程度的对转座子活性产生影响。这为活性ITm转座子的鉴定及功能分析奠定了重要基础,同时,也为人工调控ITm转座子转座活性提供了理论依据。