末端标记引物延伸反应对核酸单碱基辨认的实验研究

目的 探讨高保真DNA聚合酶的校正机制在核酸序列单碱基识别中的可能性。方法 采用三末端氚标记的引物与配对及不完全配对的模板进行引物延伸反应 ,对延伸产物片段进行放射性活性的检测。结果 当引物与模板配对时 ,其延伸产物含有可探测标记信号。当引物三末端与模板在单碱基水平不配对时 ,其延伸产物则不含可探测标记信号 ,表明引物三末端带有标记信号的碱基在高保真酶的错配纠正过程中被切除。结论 高保真酶的错配纠正机制与引物的三末端标记结合 ,能够有效辨认核酸序列单碱基 。

突变敏感性分子开关快速筛查肥厚性心肌病MYH7基因Ala26Val突变

目的利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关联合琼脂糖凝胶电泳,建立对肥厚性心肌病MYH7基因Ala26Val突变进行快速筛查的技术平台。方法应用PCR反应扩增包含MYH7基因Ala26Val突变区域的基因序列,通过基因克隆技术与反向PCR体外定点突变技术,分别得到MYH7基因Ala26Val突变的野生模板与突变模板,并通过基因测序分析进行确证。设计与Ala26Val突变位点配对及三末端不配对的3′硫化修饰正向引物,在其下游设计一条反向引物,分别构成野生引物对与突变引物对,进行高保真DNA聚合酶介导的双向引物延伸反应,利用凝胶成像系统对其PCR结果进行分析。结果当突变引物对与突变模板配对时,引物被延伸,有PCR产物;与野生模板不配对时,引物却不能被延伸,无PCR产物。同样,野生引物对只有与野生模板匹配时得以延伸,而与突变模板不匹配时则不能延伸。结论高保真DNA聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够快速筛查肥厚性心肌病MYH7基因Ala26Val突变,达到非此即彼的二元化效果,该分子开关在肥厚性心肌病基因筛查中具有巨大的潜在应用价值。