构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型验证球形脂联素的拮抗作用

目的:构建游离脂肪酸(棕榈酸)诱导胰岛细胞凋亡模型,并观察球形脂联素对胰岛细胞凋亡的拮抗作用。方法:实验于2004-15/2005-30在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型及分组:采用小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1,取对数生长期的细胞,按1×105个/孔的密度接种于6孔板,细胞生长至80%融合时将随机细胞分为3组,每组3孔,分别为对照组,棕榈酸组,棕榈酸+球形脂联素组。3组培养基均含5g/L的牛血清白蛋白、体积分数为0.03胎牛血清及体积分数为0.01的无水乙醇;棕榈酸组又加含有终浓度为500μmol/L棕榈酸;棕榈酸+球形脂联素组又加终浓度为500μmol/L棕榈酸和0.5mg/L脂联素。处理48h后终止实验。采用Hochest33342和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测棕榈酸诱导胰岛细胞凋亡率和凋亡指数及脂联素处理后脂性凋亡的改善情况。结果:①经Hochest33342染色检测3组小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数明显不同(F=300.270,P<0.05),棕榈酸组明显高于对照组犤(12.40±1.57)%,(2.05±0.59)%犦,说明500μmol/L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型,经脂联素处理后凋亡指数明显降低犤(12.40±1.57)%,(3.87±0.93)%犦,说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。②经脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数3组明显不同(F=191.221,P<0.05),棕榈酸组明显高于对照组犤(26.33±5.6)%,(2.32±0.78)%犦,说明500μmol/L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型,经脂联素处理后凋亡指数明显降低犤(2.32±0.78)%,(4.90±0.82)%,P<0.05犦说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。结论:①Hoescht染色法及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法结果均表明在体积分数为0.03胎牛血清、5g/L的牛血清白蛋白的Dulbecco改良的Eagle培养液条件下加入终浓度为500μmol/L棕榈酸处理细胞48h可成功构建胰岛细胞凋亡的细胞模型。②球形脂联素可拮抗胰岛细胞的脂性凋亡,从而发挥了其调节糖脂代谢的作用。

乳腺癌组织中p51基因的表达及其意义

背景与目的:研究p51基因与乳腺癌的关系。材料与方法:应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminaldeoxynucleotidyltransferasebiotin-dUTPnickendlabeling,TUNEL)、RT-PCR等技术检测乳腺癌组织p51基因的表达及其与细胞凋亡、激素受体的关系。结果:乳腺癌(45例)组织p51基因表达(46.7%)高于良性乳腺病变(35例)组织(11.4%);淋巴结转移阳性者p51基因表达(90.5%)明显高于阴性者(8.3%);p51基因表达与雌激素、孕激素受体无相关性(P>0.05);p51基因表达阳性的肿瘤细胞凋亡率与阴性细胞差异无统计学意义(P>0.05)。结论:P51基因表达增多可能与乳腺癌发病及转移有关。

TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡的改进

目的:脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)是检测细胞凋亡的常用方法,但以往仍有TUNEL假阳性率高的报道。本实验目的在于探讨应用TUNEL检测心肌细胞凋亡时增强其特异性的方法。方法:缺血再灌注心肌组织的石蜡切片(2μm)和冰冻切片(3μm)进行TUNEL染色。分为石蜡切片HE染色组,石蜡切片常规TUNEL组,冰冻切片改良TUNEL组。石蜡切片常规TUNEL组完全按照试剂盒说明书进行,光学显微镜下观察;冰冻切片改良TUNEL组使用荧光素(FITC)标记的dUTP及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DA-PI)双重荧光染色,在共聚焦显微镜下观察。结果:TUNEL改良法凋亡背景清晰,阳性细胞主要分布在缺血再灌注损伤区域,其凋亡检出率与石蜡切片HE染色相比无显著差异(P>0.05);常规TUNEL组凋亡背景清晰度较差,非缺血再灌注损伤区域亦有大量阳性细胞出现,其凋亡率明显高于石蜡切片HE染色(P<0.01)。结论:冰冻切片改良TUNEL法可能是更适宜研究SD大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的方法。

大鼠脑损伤后氨基胍的神经保护作用

目的探讨大鼠脑损伤后诱导性一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂———氨基胍(AG)的神经保护作用。方法采用大鼠额叶锐器损伤模型,将SD大鼠随机分成氨基胍(AG)治疗组和生理盐水(NS)对照组。用生物化学方法检测NO含量;RT-PCR法及免疫组织化学染色方法观察iNOSmRNA和iNOS阳性细胞表达变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。将两组结果进行比较。结果AG治疗组创伤区及周边NO含量、iNOSmRNA和iNOS阳性细胞表达量较NS组明显降低,凋亡细胞数量也相应明显减少。结论AG能选择性地抑制iNOS表达,减少NO过量产生,从而减少细胞凋亡,发挥神经保护作用。

C-myc基因表达及细胞凋亡在脂溢性角化病皮损中的意义

目的观察脂溢性角化病(SK)中C-myc基因表达及细胞凋亡情况,探讨脂溢性角化病的发病机制。方法对66例脂溢性角化病皮损及10例正常皮肤组织采用免疫组织化学法检测C-myc基因表达及原位细胞凋亡检测(TUNEL)法检测细胞凋亡情况。结果两组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05);SK组皮损区C-myc基因阳性细胞数百分比(21.94±19.45)%与对照组(0%)相比增加(P<0.05);66例SK皮损中有52例C-myc基因表达阳性,对照组中均无阳性表达,两组阳性率差异有统计学意义(P<0.05);TUNEL凋亡检测中SK组的凋亡指数(53.01±31.97)与对照组(33.50±23.86)比较,差异无统计学意义(P>0.05);Spearman相关性分析显示,C-myc基因在SK皮损中阳性细胞百分比与SK皮损中细胞凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05)。结论 C-myc基因参与脂溢性角化病的发生发展,脂溢性角化病皮损中细胞凋亡有所增加。该结果对研究其发病机制有一定的指导意义。

Fluoro-Jade B染色与TUNEL比较检测乙醇诱导神经细胞凋亡

目的:建立利用Fluoro-Jade B(FJ-B)染色检测乙醇诱导PC12细胞及小鼠海马脑片上神经细胞凋亡的方法并与TUNEL比较.方法:利用不同浓度的乙醇分别诱导PC12细胞和小鼠海马脑片上神经细胞凋亡,用FJ-B染色检测神经细胞凋亡,同时用TUNEL检测进行比较,从凋亡率、单位面积阳性细胞数的统计结果分析、实验过程等方面评价2种方法的优缺点.结果:2种方法检测结果显示乙醇处理组与对照组相比差异有统计学意义,2种方法相同组间对比分析差异无统计学意义.结论:FJ-B染色与TUNEL在检测乙醇对神经细胞凋亡影响的结果无差异;且FJ-B染色更适合在脑片上检测神经细胞的凋亡.

TUNEL染色结合细胞形态学特点鉴别急性胰腺炎时腺泡细胞的死亡方式

目的:通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色检测大鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)中腺泡细胞的死亡情况,探讨TUNEL染色阳性细胞的形态与细胞死亡方式之间的关系.方法:大鼠随机分为ANP组和假手术组(sham operation,SO),每组6只,利用4%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射建立大鼠急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)模型,对两组大鼠胰腺组织进行病理学观察并采用TUNEL技术对胰腺组织切片进行染色,光镜下观察TUNEL染色阳性细胞的形态学表现.结果:对比假手术组,ANP组大鼠胰腺组织出现典型的AP样病理改变,同时可见大量的TUNEL染色阳性腺泡细胞.阳性细胞之间的形态学特点各异,其中既有细胞呈凋亡表现,如核固缩和核破裂伴凋亡小体形成;也有细胞呈坏死表现,如核膨胀、核溶解以及胞质空泡化.两种细胞死亡方式的形态学表现之间存在显著差异.结论:AP时,TUNEL染色并不能很好地区分腺泡细胞的坏死与凋亡,但其联合阳性染色细胞的形态学特征可初步鉴别两种细胞死亡方式.

肾透明细胞癌发病机制中细胞凋亡的初步研究

目的:研究肾透明细胞癌发病机制与组织细胞凋亡的关系。方法:将标本离体后分成三组,(1)肾透明细胞癌组(根据肿瘤分期再分四组);(2)癌旁组织组;(3)正常肾组织组。用TUNEL法对标本检测。结果:在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生。正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,肾癌组织阳性表达最少。结论:细胞凋亡减少是肾透明细胞癌发生的重要机制之一。

重组人钙调素对小鼠胚胎发育及凋亡的影响

目的探讨外源重组人钙调素(rhCAM)对小鼠早期胚胎体外发育及凋亡的影响。方法小鼠超促排卵,收集2-细胞胚胎置于含不同浓度rhCAM的IVF-30培养液中,观察并记录胚胎形态,TUNEL法检测囊胚细胞数及囊胚细胞凋亡情况。结果20μg/ml rhCAM组的胚胎体外培养48、72 h的囊胚形成率和孵化囊胚率均高于对照组,该组体外培养72 h囊胚细胞凋亡指数显著低于对照组。200μg/ml rhCAM组的胚胎囊胚形成率低于对照组,凋亡指数显著高于对照组。结论一定浓度的rhCAM可促进胚胎体外发育并可抑制胚胎细胞的凋亡。

非小细胞肺癌凋亡指数与Bax表达的临床病理意义

目的：探讨非小细胞肺癌组织凋亡指数（AI）与Bax表达的临床病理意义。方法：应用免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶（S-P）法检测46例非小细胞肺癌切除标本以及23例癌旁正常肺组织的Bax表达情况，同时应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记（TuNEL）法检测非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织AI的大小，并比较不同年龄、不同病理类型、临床分期、不同级别、淋巴结有无转移患者Bax的表达和AI的大小。结果：肺鳞癌与肺腺癌组织中Bax的阳性表达率分别为52．38％、64．00％，低于癌旁肺组织（91．30％）（P〈0．05），不同临床病理特征患者Bax的表达差异无统计学意义（P〉0．05）。肺鳞癌、肺腺癌的AI为（5．67±3．11）％与（6．58±3．58）％，均低于癌旁正常肺组织（14．07±5．16）％（P〈0．05），Ⅲ～Ⅳ期患者AI高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P〈0．05），而其它临床病理特征患者AI差异无统计学意义（P〉O．05）。Bax阳性表达的患者AI为（6．93±2．90）％，高于Bax阴性表达的患者（5．04±3．76）％，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：非小细胞肺癌患者中Bax表达下调、缺失以及AI的下降可能在肿瘤的发生、发展中起一定的作用。

普通光学显微镜下检测精子DNA损伤的方法

目的探讨简单、稳定的普通光学显微镜下检测精子DNA损伤的方法。方法采用精子染色质扩散(SCD)试验和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)分析2种方法检测60例不育男性和30例正常生育男性的精子DNA损伤以评价精子DNA完整性,用普通光学显微镜观察结果,并应用TUNEL-SCD结合试验检测同一玻片上的精子的DNA损伤,比较两种方法的相关性,分析SCD试验检测精子DNA损伤的临床意义。结果SCD试验检测精子DNA损伤百分率,不育组和生育组分别为(23.7±9.3)%和(14.6±3.6)%,差异有统计学意义;TUNEL试验检测精子DNA损伤率,不育组和生育组分别为(21.4±7.5)%和(14.0±3.7)%,差异有统计学意义。SCD试验与TUNEL分析检测精子DNA完整性结果在不育组(r=0.906,P<0.001)和生育组(r=0.811,P<0.001)均具有明显的线性相关关系。TUNEL-SCD结合实验显示,TUNEL阳性和弱阳性精子在SCD实验中为DNA损伤精子TUNEL阴性精子为SCD实验中DNA完整精子。SCD和TUNEL法检测精子DNA损伤、精子密度、前向运动精子、正常精子形态等各单项指标预测男性不育发生的ROC曲线下面积分别为0.833、0.828、0.777、0.810和0.758,SCD检测精子DNA损伤联合精液常规参数指标(Pre1)和TUNEL检测精子DNA损伤联合精液常规参数指标(Pre2)预测男性不育发生的ROC曲线下面积分别为0.943和0.932。结论SCD试验与TUNEL试验均可在光学显微镜下检测精子DNA损伤,精子DNA完整性的检测可以作为一项男性不育检测指标。而SCD试验较TUNEL试验简单、省时,是一种值得临床推广的运用普通光学显微镜检测精子DNA完整性的方法。

依托咪酯乳剂对老年大鼠海马神经元凋亡及突触素表达的影响

目的观察腹腔注射依托咪酯乳剂对老年大鼠海马神经元突触素表达的影响。方法选择18月龄的sD大鼠45只，用完全随机分组法分为3组（每组15只）：生理盐水组（N组）、依托咪酯组（E组）、脂肪乳组（L组）。实验第1-3天，E组腹腔注射依托咪酯（乳剂）20mg／kg，L组腹腔注射20％脂肪乳20mg／kg，N组腹腔注射同等体积的生理盐水，每天1次，连续3d。实验第4天，处死大鼠，取右侧脑海马组织，固定，石蜡切片，进行细胞凋亡TUNEL检验、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase -3, caspase-3 ）Western blot检测及突触素免疫组化检验。结果TUNEL结果：海马CA1区神经元凋亡，与N组、L组比较，E组海马神经元凋亡细胞及凋亡指数无明显增加，差异无统计学意义（P〉0．05）。caspase-3表达结果：海马CA1区神经元easpase-3表达，与N组、L组比较，E组海马神经元活化caspase-3片段表达无明显增加，差异无统计学意义（P〉0．05）。突触素结果：海马CA1区神经元突触素表达，与N组、L组比较，E组海马含突触素的神经元个数无明显减少，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论腹腔注射依托咪酯乳剂20mg／kg对老年大鼠海马神经元的凋亡及突触素的表达无明显影响。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对卵巢癌裸鼠移植瘤SKOV3细胞的促凋亡研究

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白对SKOV3移植瘤细胞半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响及其与肿瘤细胞凋亡的关系。方法建立雌性裸小鼠SKOV3移植瘤24只,随机分为4组,每组6只。TRAIL组单用重组人TRAIL蛋白(10μg/kg),顺铂(DDP)组单用DDP(3 mg/kg),TRAIL+DDP组联合使用TRAIL蛋白(10μg/kg)和DDP(3 mg/kg),空白对照组给予0.5 mL生理盐水。经处理后,各组的组织切片用免疫组织化学染色检测Caspase-3的表达和末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标记技术(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡指数。结果 Caspase-3的表达水平在TRAIL组(171.67±14.38)、DDP组(172.50±14.75)、联合组(230.00±40.99)中均明显高于对照组(135.83±16.25)(P<0.05)。SKOV3移植瘤细胞凋亡指数在空白对照组、TRAIL组、DDP组和联合组分别为16.67±5.43、33.17±8.42、24.33±4.59和40.50±6.16,TRAIL组和联合组细胞凋亡指数较空白对照组和DDP组明显增高(P<0.05)。结论 TRAIL蛋白使卵巢癌移植瘤细胞的Caspase-3表达增强,TRAIL蛋白促进肿瘤细胞凋亡发生。

促红细胞生成素干预大鼠腹主动脉阻断再通过程中各指标的变化

目的观察大鼠腹主动脉阻断再通过程中肝、肾、心生化及Bcl-2和Bax基因蛋白免疫组化的变化及促红细胞生成素（Epo）的保护作用。方法采用健康雄性SD大鼠24只（体重250～300g），随机分成三组：缺血再灌注组（n=8）；促红细胞生成素（Epo）干预组（n=8）；假手术（Sham）组（n=8）。其中I／R和Epo组采用阻断腹主动脉3h，再通2h；Epo组于术前24h按5000IU／kg经腹腔注射Epo；Sham组单纯做开腹术，不做处理。术后取各只大鼠的下腔静脉血分析丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素痰（BUN）、血清肌酐（Scr）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）；各只大鼠均取肝肾心用免疫组化分析Bcl-2、Bax阳性区平均光密度；用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）分析各个标本的凋亡指数。结果I／R和Epo组的生化分析各个指标均高于Sham组．但Epo组低于I／R组（P〈0．05）。I／R和Epo组的Bcl-2和Bax阳性区平均光密度均高于Sham组，Epo组的Bcl-2阳性区平均光密度高于I／R组，Epo组的Bax阳性区平均光密度低于I／R组（P〈0.05）。Sham组TUNEL染色呈隐形，I／R和Epo组TUNEL染色呈阳性，Epo组的凋亡指数低于I／R组（P〈0.05）。结论阻断再通大鼠腹主动脉后，肝肾心发生损伤；Epo干预有助于减轻这种损伤。