基于末端脱氧核苷酸转移酶协同G-四链体核酶的恩诺沙星检测方法

基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)协同G-四链体核酶设计信号放大策略,建立了一种恩诺沙星电化学检测方法。目标物恩诺沙星与特异性核酸适体的结合触发TdT在电极表面的扩增反应,产生G-四链体核酶纳米线结构,进而发挥辣根过氧化物酶活性催化信号放大,实现恩诺沙星的高灵敏和高特异性检测。该方法对恩诺沙星的线性检测范围为0.5~50μg/L,检测限低至0.043μg/L。此外,该无标记电化学生物传感器简单快速,成本低,并成功应用于对实际食品样本的分析检测,显示出较好的应用潜能。

末端脱氧核苷酸转移酶相互作用因子1及其在癌症中的研究进展

末端脱氧核苷酸转移酶相互作用因子1(TdIF1)是一种直接与末端脱氧核苷酸转移酶结合的蛋白质。TdIF1在非小细胞肺癌、口腔癌、乳腺癌中高度表达,且这种高表达可促进癌细胞的生长。文章就TdIF1的结构、功能以及在癌症进展中的作用进行综述,指出TdIF1可能是一种潜在的癌症促进因子,为其成为癌症诊断的潜在标志物及靶向治疗的新靶标提供参考。

基于末端脱氧核苷酸转移酶扩增DNA-铜纳米簇荧光传感检测L-组氨酸

利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)扩增形成聚胸腺嘧啶(T)DNA模板,制备了聚T铜纳米簇(TS-CuNCs),构建了一种用于L-组氨酸(L-His)检测的荧光传感分析新方法。TdT酶在d TTP存在下合成聚T单链DNA核苷酸序列。由于胸腺嘧啶和Cu^(2+)之间的亲合力,聚T单链DNA作为合成铜纳米簇(CuNCs)的模板,加入还原剂后形成CuNCs,荧光强度增强。在L-His存在下,L-组氨酸的咪唑基与Cu^(2+)螯合形成L-His-Cu^(2+)配合物,因而进入聚胸腺嘧啶序列中的Cu^(2+)量减少,使得合成的CuNCs数量减少,导致荧光信号减弱。实验结果表明,体系荧光响应信号与L-His浓度的对数值在5.0×10^(-9)~5.0×10^(-4)mol/L范围内呈线性关系,检出限达到3.4×10^(-9)mol/L。本方法用于实际尿液样品中L-组氨酸检测的回收率为97.4%~104.6%,在生物医学及临床诊断中具有潜在应用价值。

末端转移酶原位标记法检测细胞凋亡

建立一种用末端转移酶标记对凋亡的细胞进行原位检测的方法。方法：在末端转移酶催化下，将地高辛修饰的核苷酸掺入凋亡细胞中的ＤＮＡ断裂缺刻，再用显色法检测被标记的ＤＮＡ，从而检出凋亡细胞。结果：本实验建立了一种灵敏、特异、有效的凋亡检测方法。结论：末端转移酶介导的原位标记法是研究凋亡的一个非常有用的工具。

末端脱氧核酸转移酶介导的功能核酸生物传感器研究进展

末端脱氧核酸转移酶(TdT酶)是一种DNA聚合酶,可以催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端,并且该反应无需特定的模板。目前,基于末端脱氧核酸转移酶可对模板核酸链的末端进行延伸这一特性,搭载不同的信号输出及扩增方式,构建了一系列的生物传感技术,如电化学生物传感器、荧光生物传感器、表面离子共振生物传感器等。对各类传感器的基本设计原理和应用进行了阐述。根据TdT酶的性质设计的一系列生物传感器具有简单、快速、廉价、灵敏度高、特异性好等优点,实现了对金属离子、病原体、蛋白质等的检测。最后对TdT酶介导的生物传感器目前的研究现状进行了总结并且对TdT酶未来的发展方向进行了展望。

基于双重脱氧核酶的超灵敏比色法检测铜离子

铜是生命的必需元素,是某些活性蛋白的辅基,而过量的铜具有一定毒性,可导致肝炎、胃肠炎、肺炎等病症。因此对Cu^(2+)的灵敏定量检测十分必要。本研究建立了一种基于双重脱氧核酶的比色生物传感器,用于灵敏、特异性定量检测Cu^(2+)。此生物传感器包含两种具有不同功能的脱氧核酶:Cu^(2+)依赖性的切割型脱氧核酶与G-四链体脱氧核酶。当待测物中存在Cu^(2+)时,Cu^(2+)依赖性的切割型脱氧核酶被切割,用于特异性信号识别;经末端转移酶诱导形成G-四链体脱氧核酶,用于"一对多"的信号放大与可视化信号输出。在"信号识别"与"信号输出"两步反应之间,利用指数扩增反应(Exponential amplification reaction,EXPAR),放大"信号识别"的反应信号。在最优条件下,可实现Cu^(2+)的灵敏的选择性检测:使用全波长酶标仪测定,比色法检出限为7.6 pmol/L;裸眼检出限为10 pmol/L。将此传感器用于自来水中Cu^(2+)的测定,裸眼检测范围为10～200 pmol/L,比色法加标回收率为96.3%～98.4%。此检测平台为特异性检测自来水中的Cu^(2+)提供了超灵敏、可视化的检测工具,具有良好的应用前景。

末端脱氧核苷酸转移酶在生物传感及核酸合成领域的应用

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)是聚合酶X家族中的一员,与典型的DNA聚合酶不同,TdT以恒温的无模板依赖的方式催化脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)聚合到寡核苷酸的3’羟基端来合成DNA。并且TdT对底物的耐受性高具有聚合修饰型dNTP的能力,如荧光修饰的dNTP、生物素修饰的dNTP,甚至人工碱基均可作为其良好底物。TdT的这些生化特性使其被广泛的应用在生物传感和核酸合成领域中,促进了许多基于核酸的工具和方法的发展,并为酶促从头合成DNA技术的发展奠定基础。介绍了TdT的性质,重点总结了它在其介导的生物检测技术、核酸的修饰技术以及酶促合成DNA技术三个方面的核心作用、目前面临的挑战以及未来研究的方向,以期促进TdT在生物传感器和核酸合成中的进一步应用。

一种双脱氧核苷封闭的寡聚核苷酸制备方法

[目的]建立一种高效、简便制备双脱氧核苷(ddATP、ddTTP、ddGTP和ddCTP)封闭寡聚核苷酸的方法。[方法]选取乙醛脱氢酶(ALDH)基因,设计特异性上、下游引物。使用末端转移酶和碱性磷酸酶对引物进行双脱氧核苷修饰,利用荧光定量PCR对制备的封闭引物进行验证,并结合校读PCR对突变体进行检测。[结果]经过ddNTP封闭的引物,在普通荧光PCR体系中无法进行引物延伸;在校读PCR体系中则可以区分ALDH2的两种等位基因。[结论]该方法可以高效合成4种双脱氧核苷封闭的寡聚核苷酸,并且这种封闭的引物可以结合校读PCR对单核苷多态性进行检测。

TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡的改进

目的:脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)是检测细胞凋亡的常用方法,但以往仍有TUNEL假阳性率高的报道。本实验目的在于探讨应用TUNEL检测心肌细胞凋亡时增强其特异性的方法。方法:缺血再灌注心肌组织的石蜡切片(2μm)和冰冻切片(3μm)进行TUNEL染色。分为石蜡切片HE染色组,石蜡切片常规TUNEL组,冰冻切片改良TUNEL组。石蜡切片常规TUNEL组完全按照试剂盒说明书进行,光学显微镜下观察;冰冻切片改良TUNEL组使用荧光素(FITC)标记的dUTP及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DA-PI)双重荧光染色,在共聚焦显微镜下观察。结果:TUNEL改良法凋亡背景清晰,阳性细胞主要分布在缺血再灌注损伤区域,其凋亡检出率与石蜡切片HE染色相比无显著差异(P>0.05);常规TUNEL组凋亡背景清晰度较差,非缺血再灌注损伤区域亦有大量阳性细胞出现,其凋亡率明显高于石蜡切片HE染色(P<0.01)。结论:冰冻切片改良TUNEL法可能是更适宜研究SD大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的方法。

构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型验证球形脂联素的拮抗作用

目的:构建游离脂肪酸(棕榈酸)诱导胰岛细胞凋亡模型,并观察球形脂联素对胰岛细胞凋亡的拮抗作用。方法:实验于2004-15/2005-30在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型及分组:采用小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1,取对数生长期的细胞,按1×105个/孔的密度接种于6孔板,细胞生长至80%融合时将随机细胞分为3组,每组3孔,分别为对照组,棕榈酸组,棕榈酸+球形脂联素组。3组培养基均含5g/L的牛血清白蛋白、体积分数为0.03胎牛血清及体积分数为0.01的无水乙醇;棕榈酸组又加含有终浓度为500μmol/L棕榈酸;棕榈酸+球形脂联素组又加终浓度为500μmol/L棕榈酸和0.5mg/L脂联素。处理48h后终止实验。采用Hochest33342和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测棕榈酸诱导胰岛细胞凋亡率和凋亡指数及脂联素处理后脂性凋亡的改善情况。结果:①经Hochest33342染色检测3组小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数明显不同(F=300.270,P<0.05),棕榈酸组明显高于对照组犤(12.40±1.57)%,(2.05±0.59)%犦,说明500μmol/L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型,经脂联素处理后凋亡指数明显降低犤(12.40±1.57)%,(3.87±0.93)%犦,说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。②经脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数3组明显不同(F=191.221,P<0.05),棕榈酸组明显高于对照组犤(26.33±5.6)%,(2.32±0.78)%犦,说明500μmol/L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型,经脂联素处理后凋亡指数明显降低犤(2.32±0.78)%,(4.90±0.82)%,P<0.05犦说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。结论:①Hoescht染色法及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法结果均表明在体积分数为0.03胎牛血清、5g/L的牛血清白蛋白的Dulbecco改良的Eagle培养液条件下加入终浓度为500μmol/L棕榈酸处理细胞48h可成功构建胰岛细胞凋亡的细胞模型。②球形脂联素可拮抗胰岛细胞的脂性凋亡,从而发挥了其调节糖脂代谢的作用。

细胞凋亡原位检测的TUNEL法

细胞凋亡原位检测的ＴＵＮＥＬ法刘勇（江西省人民医院病理科，南昌３３０００６）细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ），又称程序性细胞死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ），是细胞的一种生理性死亡过程，有关细胞凋亡的研究近年来受到高度重视。末端转移...

免疫双标记细胞的检测在中枢神经系统白血病诊断中的意义

目的 :观察末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)及淋巴细胞系列相关抗原双标记细胞在脑脊液中的检出对中枢神经系统白血病 (CNS L)的临床意义。方法 :采用免疫荧光标记技术配合流式细胞术 ,检测初治或完全缓解期急性淋巴细胞白血病脑脊液中TdT及淋巴系列相关抗原双标记细胞及其治疗后的变化。结果 :6 4例中 8例脑脊液检出上述免疫双标记细胞 ,均为急性淋巴细胞白血病 ,其中 1例无CNS L临床迹象 ,免疫双标记细胞占3.38% ,经治疗后免疫双标记细胞在脑脊液均明显减少或消失。结论 :脑脊液中免疫双标记细胞的检出对CNS L的诊断及治疗指导具有重要的临床意义 。

普通光学显微镜下检测精子DNA损伤的方法

目的探讨简单、稳定的普通光学显微镜下检测精子DNA损伤的方法。方法采用精子染色质扩散(SCD)试验和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)分析2种方法检测60例不育男性和30例正常生育男性的精子DNA损伤以评价精子DNA完整性,用普通光学显微镜观察结果,并应用TUNEL-SCD结合试验检测同一玻片上的精子的DNA损伤,比较两种方法的相关性,分析SCD试验检测精子DNA损伤的临床意义。结果SCD试验检测精子DNA损伤百分率,不育组和生育组分别为(23.7±9.3)%和(14.6±3.6)%,差异有统计学意义;TUNEL试验检测精子DNA损伤率,不育组和生育组分别为(21.4±7.5)%和(14.0±3.7)%,差异有统计学意义。SCD试验与TUNEL分析检测精子DNA完整性结果在不育组(r=0.906,P<0.001)和生育组(r=0.811,P<0.001)均具有明显的线性相关关系。TUNEL-SCD结合实验显示,TUNEL阳性和弱阳性精子在SCD实验中为DNA损伤精子TUNEL阴性精子为SCD实验中DNA完整精子。SCD和TUNEL法检测精子DNA损伤、精子密度、前向运动精子、正常精子形态等各单项指标预测男性不育发生的ROC曲线下面积分别为0.833、0.828、0.777、0.810和0.758,SCD检测精子DNA损伤联合精液常规参数指标(Pre1)和TUNEL检测精子DNA损伤联合精液常规参数指标(Pre2)预测男性不育发生的ROC曲线下面积分别为0.943和0.932。结论SCD试验与TUNEL试验均可在光学显微镜下检测精子DNA损伤,精子DNA完整性的检测可以作为一项男性不育检测指标。而SCD试验较TUNEL试验简单、省时,是一种值得临床推广的运用普通光学显微镜检测精子DNA完整性的方法。

TdT阴性的淋巴母细胞淋巴瘤/急性淋巴细胞白血病临床特点、诊断及预后研究进展

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotide transferase,TdT)是一种特殊类型的DNA聚合酶,它可以在无DNA复制模板的条件下将单个脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'-OH端。TdT是造血系统中不成熟淋巴细胞中特异性较强的细胞内标记,在淋巴源性肿瘤的诊断中具有重要意义。淋巴母细胞淋巴瘤/急性淋巴细胞白血病(lymphoblastic lymphoma/acute lymphoblastic leukemia,LBL/ALL)的诊断依赖免疫分型。TdT通常在LBL/ALL中呈阳性表达,是临床诊断LBL/ALL的重要依据。TdT阴性的LBL/ALL在临床中较为少见,鉴于该分子诊断特异性较高,其阴性表达会给诊断带来一定的困难。TdT阴性的原因有多种,在淋巴细胞不同分化阶段中TdT的表达情况不同,另因不同检测方法的灵敏度不同,也可导致偶见TdT的假阴性。此外,有文献指出TdT阴性与TdT阳性的LBL/ALL在临床特点及预后方面亦不相同。了解TdT的表达意义、阴性的原因,以及阴性或阳性表达的LBL/ALL的不同特点,有助于临床诊断、治疗选择及预后判断。该文对国内外相关文献进行了梳理,就TdT阴性的原因及其表达阴性的LBL/ALL的临床特点、诊断及预后等进行综述。

黄皮酰胺对高血压局灶性脑缺血-再灌注大鼠Bcl-2蛋白表达和细胞凋亡的影响

目的观察黄皮酰胺对肾性高血压大鼠(RHR)脑缺血-再灌注后Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡的影响,探讨其脑保护作用机制。方法75只RHR被随机分成假手术组、单纯缺血-再灌注组和黄皮酰胺组。采用线栓法制作局灶性脑缺血-再灌注模型,假手术组不造成缺血。用免疫组化法和原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL法)分别观察缺血2h后再灌注6、12、24、48和72h脑细胞Bcl-2蛋白表达和凋亡细胞数。结果①再灌注6h即可见Bcl-2蛋白表达较多,24h达高峰,此后逐渐下降。与单纯缺血-再灌注组比较,黄皮酰胺组Bcl-2蛋白表达于再灌注后各时间点均明显增高,差异均有显著性(P均<0.01)。②再灌注6h后有较多凋亡细胞,于72h达高峰。与单纯缺血-再灌注组比较,再灌注6-24h黄皮酰胺组凋亡细胞均显著减少(P均<0.01),但再灌注48h后细胞凋亡的抑制作用不明显(P均>0.05)。假手术组及缺血-再灌注组的非缺血侧无Bcl-2阳性细胞,仅见0-2个凋亡细胞。结论局灶性脑缺血-再灌注后Bcl-2表达显著增高,细胞凋亡参与了脑缺血-再灌注损伤的过程。黄皮酰胺能显著上调Bcl-2表达,抑制细胞凋亡,并可能与Bcl-2协同抑制细胞凋亡,这可能是黄皮酰胺脑保护作用的机制。

家榆种子老化过程中ROS-类caspse-3途径的初步研究

以家榆种子为试材,在37℃、100%相对湿度下进行老化处理后,结合DAPI染色和细胞原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)、激光共聚焦技术以及生化分析,检测家榆种子人工诱导老化过程中细胞核、活性氧(ROS)和类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的变化.结果显示:随着老化程度加深,种子细胞染色质皱缩、凝聚,继而解体并被排出体外;表皮中最先发现TUNEL凋亡核,而后逐渐延伸到子叶和胚轴;老化处理5d时种子活性氧信号最强,且其与程序性死亡相关事件的发生具有时空一致性,同时在胞浆中检测到较强的caspase-3活性.研究表明,家榆种子人工老化可导致细胞程序性死亡,且存在与ROS迸发及类caspase-3相关联的信号通路.

大鼠肝移植术后肝脏T淋巴细胞凋亡与免疫耐受的关系

目的探讨肝移植术后肝组织T淋巴细胞凋亡和肝移植免疫耐受之间的关系。方法采用Kamada二袖套法建立Wistar→Sprague-Dawley(SD)原位肝移植(OLT)大鼠模型。实验动物随机分为3组,每组各6只。A组:空白对照组,不作任何处理,采用SD大鼠;B组:免疫排斥组,Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体,行OLT;C组:免疫耐受组,Wistar大鼠为供体、SD大鼠为受体,行OLT,术前1周胸腺内注射F蛋白0.4mg,建立稳定的移植耐受大鼠模型。A组立即处死大鼠,B组和C组分别于术后7d、100d处死大鼠取肝组织,分别取各组大鼠肝组织标本进行冰冻切片,应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)在荧光显微镜下检测肝移植术后肝脏T淋巴细胞的凋亡情况。各组样本另取一张切片行常规苏木素-伊红(HE)染色在光学显微镜下观察,与TUNEL荧光染色法作对比观察。结果光学显微镜下,B组可见中、重度免疫排斥反应表现,C组肝组织细胞间的淋巴细胞浸润较B组大大减少,稍多于A组。荧光显微镜下,A组TUNEL切片可见零星散在的凋亡细胞,C组可见大量散在或密集分布的凋亡细胞,B组的凋亡细胞数远较C组减少,但仍多于A组。A组、B组、C组大鼠肝组织内浸润T淋巴细胞的凋亡指数(apoptosisindex,AI)分别为(8.83±0.43)%、(11.32±1.29)%和(19.00±1.96)%,两两比较差异有统计学意义(P<0.05～0.01)。结论免疫耐受移植物内浸润的T淋巴细胞凋亡明显增高,浸润的T淋巴细胞凋亡受阻可能会阻碍免疫耐受的发生,引起排斥反应。

半胱氨酸蛋白酶32在丝裂霉素C诱导膀胱癌细胞凋亡中的作用

目的 探讨半胱氨酸蛋白酶 32 (caspase 3)在丝裂霉素C(MMC)诱导膀胱癌EJ细胞凋亡中的作用。 方法 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导生物素标记法 (TUNEL)和流式细胞术 (FCM)研究EJ细胞凋亡及细胞周期变化 ,分析caspase 3抗体对低剂量MMC诱导EJ细胞凋亡的影响。 结果 TUNEL法显示MMC组EJ细胞出现细胞凋亡特有的形态学特征 ,凋亡指数 (6 2 .9± 2 .2 ) % ,较cas pase 3抗体加MMC组 (4.9± 0 .3) %和空白组 (2 .7± 0 .7) %显著增高 (P <0 .0 0 1)。FCM检测结果明 ,MMC主要诱导G0 /G1期细胞凋亡而出现凋亡峰 ,凋亡率 2 6 .0 6 % ;caspase 3抗体能特异性抑制MMC诱导EJ细胞凋亡 ,凋亡率仅为 4.6 5 %。 结论 低剂量MMC对caspase 3的活化在诱导膀胱癌细胞凋亡中有重要作用。

大鼠脑损伤后氨基胍的神经保护作用

目的探讨大鼠脑损伤后诱导性一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂———氨基胍(AG)的神经保护作用。方法采用大鼠额叶锐器损伤模型,将SD大鼠随机分成氨基胍(AG)治疗组和生理盐水(NS)对照组。用生物化学方法检测NO含量;RT-PCR法及免疫组织化学染色方法观察iNOSmRNA和iNOS阳性细胞表达变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。将两组结果进行比较。结果AG治疗组创伤区及周边NO含量、iNOSmRNA和iNOS阳性细胞表达量较NS组明显降低,凋亡细胞数量也相应明显减少。结论AG能选择性地抑制iNOS表达,减少NO过量产生,从而减少细胞凋亡,发挥神经保护作用。