末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展

末端限制性酶切片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment LengthPolymorphism,T-RFLP)是近年来发展起来的、不依赖于培养的微生物群落分析方法之一.由于其在微生物群落结构分析方面的特点,包括分辨率高、易于实现自动化及互联网海量数据共享等优势,自1997年最先被报道以来得到了广泛的应用,成为环境微生物群落分析的最强有力的工具之一.类似于其他的分子微生物生态学技术,T-RFLP也有自身的缺陷,本文详细介绍了T-RFLP技术的原理及其解析环境微生物群落的基本流程,简述了近年来T-RFLP技术在群落分析中的研究进展,重点讨论了该技术的局限性及相应的解决办法.

应用末端标记限制性片段长度多态性技术分析胆固醇结石内的菌群构成

末端标记限制性片段长度多态性是一种新兴的微生物生态学技术,以胆囊内的微生物群落16S rDNA为目标,利用此技术对胆囊结石患者体内结石和胆汁的微生物群落结构进行定性和定量分析,根据分析结果与正常人体内的胆汁进行比较,从而阐明胆结石患者与正常人体胆囊内微生物群落结构的差异性,为进一步预防和控制胆囊结石的发生提供有用的依据。

限制性末端片段长度多态性分析技术及其在肠道微生物研究中的应用

限制性末端片段长度多态性分析技术(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)具有高通量,低成本,低劳动力等特点,是微生物生态学家在探索群落结构,功能及其动态变化中的一项实用方便的工具。自2012年至今,T-RFLP在肠道微生物领域研究方向不断拓宽,随后T-RFLP技术被更多的应用于人体相关疾病与肠道微生物关系的研究中。尽管T-RFLP技术仍存在不足,但随着16Sr RNA基因序列数据库和引物的改进,数据生成和分析统计工具的运用,T-RFLP最终将能在各个领域体现其价值,为人类疾病研究事业带来贡献。

利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

现代生物技术在环境微生物学中的应用:Ⅲ.限制性片段长度多态性分析、变性/温度梯度凝胶电泳和报道基因

这是现代生物技术在环境微生物学中的应用系列综述文章的第三篇 ,讨论限制性片段长度多态性 (RFLP)分析、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)和温度梯度凝胶电泳 (TGGE)以及报道基因。

骨科假体相关性感染的末端限制性片段长度多态性分析

背景:随着骨科假体植入的增加,假体相关性感染日益增多。只有深入研究感染中病原菌的分布特点,才能对假体相关性感染的机理和治疗方式有更全面的认识。目的:应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术分析骨科假体相关性感染的细菌学特征。方法:选取骨科假体相关性感染患者的感染灶样本15例和非假体相关性感染患者的感染灶样本10例,提取样本总DNA,对其16S rDNA进行PCR扩增,应用T-RFLP技术分析样本中微生物群落分布情况。结果:假体相关性感染组检测阳性率为46.7%,非假体相关性感染组检测阳性率为20%;聚类分析结果显示相同解剖部位的感染中细菌群落分布均具有很高的相似性。结论:假体相关性感染检测阳性率高于非假体相关性感染;无论有无假体存在,相同解剖部位的感染中细菌群落的分布具有很高的相似性。

IS6110-限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的评价IS6110-限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）和间隔区寡核苷酸分型技术（spoligotyping）两种方法在结核病流行病学中的应用，探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株，分别应用IS6110-RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果①IS6110-RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。②将本次实验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果有14个类型属于共有类型，其中类型1为流行的类型，分布广泛，即所说的北京基因型。③广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义（P〈0．05）。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论同时应用IS6110-RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效，在中国不同地区的菌株具有不同的特点。

微生物末端限制性片段的长度多态性研究新进展

有效的比对不同环境下微生物群落基因组间的差异,可为刑事侦查中鉴定不同物证的来源或异同,提供有效的分析思路;微生物基因组16S rRNA有多个区段高度保守,可以设计出通用引物,扩增所有细菌的16S rRNA片段,而16S rRNA可变区的差异则可以用来区分不同的细菌;近年来发展起来的T-RFLP(末端标记限制性片段长度多态性)技术为该策略的实施提供了新的技术平台;本文对近年来T-RFLP分析的研究进展进行了系统回顾,对其关键技术,包括引物及限制酶的选择、末端片段的解析、信号的区分以及图谱的解读等方面的最新研究方法进行了系统的比较和评价,以期为其在法庭科学中的实践提供相应的参考和帮助。

限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技术的优点

限制性片段长度多态性（RFLP）技术是最早开发成功、建立在Southern杂交技术上的DNA分子遗传标记技术。RFLP技术的优点：

扩增片段长度多态（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是一种十分理想的分子标记技术

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）标记技术是Zabean和Vos等科学家发展起来的一种新的分子标记技术。于1993年获得欧洲专利局专利。它是继限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）、随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）之后的第三代标记技术。

DNA多态性分析技术及其在蚕业上的应用

现代分子生物学的迅猛发展,使整个生命科学研究发生了深刻的革命.由之而孕育出的以基因组DNA多态性分析为核心的分子标记(molecular marker)技术,使人们对于生物遗传差异的认识,由表型(产物)特征深入到了分子水平,产生了由现象到本质的飞跃.DNA多态性是指基因组DNA在漫长的生命繁演历程中所发生的自然突变(DNA片断的插入、缺失、重排或碱基置换)状况的差异性.这种差异反映了基因组的本质特征。

单核苷酸多态性与原发性肝癌易感性及临床病理学的相关分析

目的:探讨单核苷酸多态性(SNP)与本地区原发性肝癌(PHC)遗传易感性的关系,并探究SNP位点数目与肝癌患者临床病理学的相关性。方法:采用聚合酶链反应–限制性片段长度多态性技术检测234例肝癌患者和234例阴性对照的27个PHC相关SNP位点基因型和等位基因分布频率,并分析SNP位点与PHC遗传易感性、肝癌患者临床病理学和SNP位点数目的相关性。结果:1) miR-34b/c基因rs4938723位点CC基因型(调整OR = 1.736,95%CI:1.036~2.910,P = 0.036)、EGF基因rs4444903位点GG基因型(调整OR = 1.841,95%CI:1.103~3.071,P = 0.019)具有更高的PHC患病风险;KIF1B基因rs17401966位点GG基因型具有更低的PHC患病风险(调整OR = 0.540,95%CI:0.314~0.930,P = 0.026);分层分析结果显示在男性(P = 0.039)和饮酒(P = 0.025)的人群中EGF基因rs4444903位点基因型GG相比AA + AG基因型PHC发病风险增加;在女性(P = 0.013)、年龄 < 60岁(P = 0.026)及不饮酒(P = 0.039)人群中KIF1B基因rs17401966位点GG基因型相比AA + AG基因型PHC发病风险降低。2) SNP位点数目与门静脉癌栓发生率增加有关(调整OR = 1.122,95%CI:1.005~1.251,P = 0.040)。结论:miR-34b/c基因rs4938723、EGF基因rs4444903、KIF1B基因rs17401966单核苷酸多态性与本地区PHC风险相关,SNP位点数目与肝癌患者临床病理学具有相关性。

IS6110限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的评价IS6110限制性片段长度多态性(IS6110RFLP)和间隔区寡核苷酸分型技术(spoligotyping)两种方法在结核病流行病学上的应用,探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株,分别应用IS6110RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果(1)IS6110RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。(2)将本次试验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果有14个类型属于共有类型,其中类型1为流行的类型,分布广泛,即所说的北京基因型。(3)广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义(P<0.05)。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论同时应用IS6110RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效,在中国不同地区的菌株具有不同的特点。

末端限制性片段长度多态性技术在引起酵母提前絮凝的麦芽微生物群落分析中的应用

摘要：本文分别从麦芽微生物总DNA的提取、荧光标记引物的选择、产物的限制性酶切等条件建立并优化微生物群落分析技术-末端限制性片段长度多态性技术，利用该技术分析不同品种不同PYF值和同一品种高低不同PYF值麦芽微生物群落，确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物。结果表明采用0．1g麦芽进行微生物DNA提取，采用FAM对引物进行荧光标记，细菌PCR产物采用HaeⅢ、Mspl、Rsal3种限制性内切酶联合酶切，真菌PCR产物采用HaeⅢ、Hinfl、Rsal联合酶切，建立的T—RFLP技术确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物为镰刀菌Fusamm、曲霉菌Aspergillus、核腔菌Pyrenophora。

末端限制性片段长度多态性技术在引起酵母提前絮凝的麦芽微生物群落分析中的应用

本文分别从麦芽微生物总DNA的提取、荧光标记引物的选择、产物的限制性酶切等条件建立并优化微生物群落分析技术-末端限制性片段长度多态性技术,利用该技术分析不同品种不同PYF值和同一品种高低不同PYF值麦芽微生物群落,确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物.结果表明采用0.1g麦芽进行微生物DNA提取,采用FAM对引物进行荧光标记,细菌PCR产物采用HaeⅢ、Mspl、Rsal 3种限制性内切酶联合酶切,真菌PCR产物采用HaeⅢ、Hinfl、Rsal联合酶切,建立的T-RFLP技术确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物为镰刀菌Fusarium、曲霉菌Aspergillus、核腔菌Pyrenophora.

环境微生物群落分析的T-RFLP技术及其优化措施

末端限制性酶切片段长度多态性分析(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)是近年来发展起来的、不依赖于培养的微生物群落分析方法之一.由于其在微生物群落结构分析方面的特点,包括分辨率高、易于实现自动化及互联网海量数据共享等优势,自1997年最先被报道以来得到了广泛的应用,成为环境微生物群落分析的最强有力的工具之一.本文详细介绍了T-RFLP技术的原理,并从环境样品群落DNA的提取、引物设计和PCR扩增、限制性酶切、电泳分离检测和T-RFLP图谱解析等5个方面讨论了用该技术解析环境微生物群落的方法和技巧,简述了近8 a来国外T-RFLP技术在群落分析中的研究进展.类似于其他的分子微生物生态学技术, T-RFLP也有自身的缺陷,因此重点分析了该技术的局限性及相应的解决办法.

载脂蛋白E基因多态性和动脉瘤性自发蛛网膜下腔出血预后相关性

目的 探讨载脂蛋白E(ApoE)基因多态性和动脉瘤性自发蛛网膜下腔出血 (SAH)预后的关系。 方法 对 10 4例动脉瘤性SAH患者采用哥拉斯格预后评分 (GOS) ,对伤后 3个月的恢复情况进行评估。测定患者的血脂ApoE基因多态性 ,通过限制性片段长度多态性而确定 (RFLP)。结果 病例组的基因型和等位基因频率与正常对照组无显著性差异 (P >0 .0 5 )。在 18例ApoE∈ 4等位基因携带者中有 5例 (2 7.8% )预后不良 ,明显高于非∈4等位基因携带者 (8.1% ,P =0 .0 32 ) ;单因素和多因素Logistic回归均提示仅∈ 4是预后不良的危险因素 (单因素OR =4 .34,P =0 .0 2 6 ;多因素OR =6 .95 ,P =0 .0 30 )。结论 APOE∈ 4等位基因是动脉瘤性SAH患者预后不良的危险因素。

我国汉族人骨钙素基因多态性和骨质疏松关系的初步研究

目的 骨钙素 (OC)基因是骨代谢遗传基础的侯选基因之一 ,本研究旨在探讨OC基因多态性的分布规律及与骨质疏松 (OP)的相关性。方法 采用银染法聚合酶链反应限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术对 85例正常对照者和 1 2例骨质疏松症的患者OC基因进行分型 ,并计算其基因型频率、等位基因频率。结果 汉族正常对照组OC基因hh ,Hh ,HH基因型分别为 61 1 8% ,35 2 9% ,3 53 % ,等位基因频率H型和h型分别为 0 2 1 1 8和 0 7882 ,与骨质疏松组比较无显著性差异。比数比分析 ,骨密度 (BMD)较低的HH基因型OP的相对危险度是BMD较高的hh型的 3 47倍 ,是Hh型的 1 73倍。结论 就目前调查例数而言 ,中国汉族人OC基因型与骨质疏松无明显相关性 ,但是 ,HH基因型有较高的OP发病趋势。

T-RFLP技术及其在微生物群落结构研究中的应用

作者介绍了末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析技术的基本原理和操作方法,并就该方法在生态环境中、动物和人体内微生物群落结构的研究应用情况做了综述。由于T-RFLP分析技术不依赖于细菌培养,并且整合了自动测序仪的高分辨率和高通量特征,因此,对于分析复杂的群落结构比其它的指纹识别技术具有更明显的优势,最后分析了此种技术的不足之处并对它的应用前景做出了展望。