末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展

末端限制性酶切片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment LengthPolymorphism,T-RFLP)是近年来发展起来的、不依赖于培养的微生物群落分析方法之一.由于其在微生物群落结构分析方面的特点,包括分辨率高、易于实现自动化及互联网海量数据共享等优势,自1997年最先被报道以来得到了广泛的应用,成为环境微生物群落分析的最强有力的工具之一.类似于其他的分子微生物生态学技术,T-RFLP也有自身的缺陷,本文详细介绍了T-RFLP技术的原理及其解析环境微生物群落的基本流程,简述了近年来T-RFLP技术在群落分析中的研究进展,重点讨论了该技术的局限性及相应的解决办法.

应用末端标记限制性片段长度多态性技术分析胆固醇结石内的菌群构成

末端标记限制性片段长度多态性是一种新兴的微生物生态学技术,以胆囊内的微生物群落16S rDNA为目标,利用此技术对胆囊结石患者体内结石和胆汁的微生物群落结构进行定性和定量分析,根据分析结果与正常人体内的胆汁进行比较,从而阐明胆结石患者与正常人体胆囊内微生物群落结构的差异性,为进一步预防和控制胆囊结石的发生提供有用的依据。

限制性末端片段长度多态性分析技术及其在肠道微生物研究中的应用

限制性末端片段长度多态性分析技术(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)具有高通量,低成本,低劳动力等特点,是微生物生态学家在探索群落结构,功能及其动态变化中的一项实用方便的工具。自2012年至今,T-RFLP在肠道微生物领域研究方向不断拓宽,随后T-RFLP技术被更多的应用于人体相关疾病与肠道微生物关系的研究中。尽管T-RFLP技术仍存在不足,但随着16Sr RNA基因序列数据库和引物的改进,数据生成和分析统计工具的运用,T-RFLP最终将能在各个领域体现其价值,为人类疾病研究事业带来贡献。

利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的 建立简便易行的检测乙型肝炎病毒 (HBV)多聚酶基因 (P基因 )上YMDD变异株的方法 ,评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者对此变异的影响。方法 采用套式 /错配聚合酶链反应 (PCR)结合限制性片段长度多态性 (RFLP)分析技术对 10 8例治疗前HBVDNA(PCR)阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBVYMDD变异情况进行检测。结果 运用上述技术能有效区分HBVYMDD野生株和变异株 ;上述 10 8例患者经拉米夫定治疗后 ,HBVDNA阴转者 63例 (5 8 3 % ) ,HBVYMDD野生株和变异株分别为 2 3例 (2 1 3 % )和 2 2例 (2 0 4% )。结论 建立的套式 /错配PCR -RFLP分析技术可用于HBVYMDD变异株的临床监测 ;

利用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿骨种属来源的研究

目的:建立一种基于限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿骨粉的种属来源的方法。方法:对脱钙后的动物骨粉样品进行核糖核酸提取,通过聚合酶链式反应对梅花鹿特征片段进行扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对其种属来源进行确证。结果:通过对特征片段进行聚合酶链式反应扩增,可将梅花鹿及马鹿来源的骨粉样品与牛、猪、狗等动物骨粉样品进行区分。通过对限制性内切酶XbaI进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿与马鹿来源的骨粉样品。结论:建立了一种基于限制性片段长度多态性技术的梅花鹿骨粉种属来源的鉴别方法。

现代生物技术在环境微生物学中的应用:Ⅲ.限制性片段长度多态性分析、变性/温度梯度凝胶电泳和报道基因

这是现代生物技术在环境微生物学中的应用系列综述文章的第三篇 ,讨论限制性片段长度多态性 (RFLP)分析、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)和温度梯度凝胶电泳 (TGGE)以及报道基因。

末端限制性片段长度多态性技术在引起酵母提前絮凝的麦芽微生物群落分析中的应用

摘要：本文分别从麦芽微生物总DNA的提取、荧光标记引物的选择、产物的限制性酶切等条件建立并优化微生物群落分析技术-末端限制性片段长度多态性技术，利用该技术分析不同品种不同PYF值和同一品种高低不同PYF值麦芽微生物群落，确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物。结果表明采用0．1g麦芽进行微生物DNA提取，采用FAM对引物进行荧光标记，细菌PCR产物采用HaeⅢ、Mspl、Rsal3种限制性内切酶联合酶切，真菌PCR产物采用HaeⅢ、Hinfl、Rsal联合酶切，建立的T—RFLP技术确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物为镰刀菌Fusamm、曲霉菌Aspergillus、核腔菌Pyrenophora。

骨科假体相关性感染的末端限制性片段长度多态性分析

背景:随着骨科假体植入的增加,假体相关性感染日益增多。只有深入研究感染中病原菌的分布特点,才能对假体相关性感染的机理和治疗方式有更全面的认识。目的:应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术分析骨科假体相关性感染的细菌学特征。方法:选取骨科假体相关性感染患者的感染灶样本15例和非假体相关性感染患者的感染灶样本10例,提取样本总DNA,对其16S rDNA进行PCR扩增,应用T-RFLP技术分析样本中微生物群落分布情况。结果:假体相关性感染组检测阳性率为46.7%,非假体相关性感染组检测阳性率为20%;聚类分析结果显示相同解剖部位的感染中细菌群落分布均具有很高的相似性。结论:假体相关性感染检测阳性率高于非假体相关性感染;无论有无假体存在,相同解剖部位的感染中细菌群落的分布具有很高的相似性。

IS6110-限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的评价IS6110-限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）和间隔区寡核苷酸分型技术（spoligotyping）两种方法在结核病流行病学中的应用，探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株，分别应用IS6110-RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果①IS6110-RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。②将本次实验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果有14个类型属于共有类型，其中类型1为流行的类型，分布广泛，即所说的北京基因型。③广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义（P〈0．05）。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论同时应用IS6110-RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效，在中国不同地区的菌株具有不同的特点。

应用限制性片段长度多态性分析技术研究乙醇脱氢酶2的基因多态型

分子遗传学技术的发展使得我们对与遗传有关疾病的认识达到了新的境界。通过产前对个体所携有的基因多态型的研究可以对某些疾病进行早期预测，从而达到预防、优生优育的目的。酒精脱氢酶２基因就是一个鲜明的例子，个体带有的基因型不同其表现型也不同，它与胎儿酒精综合征、胎儿酒精效应及酒精相关疾病存在着一定联系。为此本文采用限制性片段长度多态性分析技术研究酒精脱氢酶２的基因，根据基因的变化。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性和芯片生物分析技术用于渤海地区鱼种鉴定

以渤海湾具有重要商业价值的9种海鱼(小黄鱼、花鲈、蓝点马鲛、鲐、钝吻黄盖鲽、棘头梅童鱼、许氏平鲉、高眼鲽和长蛇鲻)为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)和芯片生物分析技术对其进行鱼种鉴定。首先提取其基因组脱氧核糖核酸(DNA),对其细胞色素b的特定片段(464bp)进行扩增,然后选择DdeⅠ、HaeⅢ和NlaⅢ3种限制性内切酶进行酶切,并利用芯片生物分析技术得到酶切产物的特异图谱和确切的片段大小,从而有效区分了9种海鱼。研究结果表明,PCR-RFLP和芯片生物分析技术在鱼种鉴定上具有精确、鉴别和快速三大优势,可为鱼类食品检测提供科学依据。

末端限制性片段长度多态性技术在引起酵母提前絮凝的麦芽微生物群落分析中的应用

本文分别从麦芽微生物总DNA的提取、荧光标记引物的选择、产物的限制性酶切等条件建立并优化微生物群落分析技术-末端限制性片段长度多态性技术,利用该技术分析不同品种不同PYF值和同一品种高低不同PYF值麦芽微生物群落,确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物.结果表明采用0.1g麦芽进行微生物DNA提取,采用FAM对引物进行荧光标记,细菌PCR产物采用HaeⅢ、Mspl、Rsal 3种限制性内切酶联合酶切,真菌PCR产物采用HaeⅢ、Hinfl、Rsal联合酶切,建立的T-RFLP技术确定麦芽中引起酵母提前絮凝的微生物为镰刀菌Fusarium、曲霉菌Aspergillus、核腔菌Pyrenophora.

微生物末端限制性片段的长度多态性研究新进展

有效的比对不同环境下微生物群落基因组间的差异,可为刑事侦查中鉴定不同物证的来源或异同,提供有效的分析思路;微生物基因组16S rRNA有多个区段高度保守,可以设计出通用引物,扩增所有细菌的16S rRNA片段,而16S rRNA可变区的差异则可以用来区分不同的细菌;近年来发展起来的T-RFLP(末端标记限制性片段长度多态性)技术为该策略的实施提供了新的技术平台;本文对近年来T-RFLP分析的研究进展进行了系统回顾,对其关键技术,包括引物及限制酶的选择、末端片段的解析、信号的区分以及图谱的解读等方面的最新研究方法进行了系统的比较和评价,以期为其在法庭科学中的实践提供相应的参考和帮助。

用DNA限制性片段长度多态性鉴定中国旋毛虫3个分离株

以旋毛虫国际标准虫株Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ（Ｔｓ）、Ｔ．ｎａｔｉｖａ（Ｔｎ）和Ｔ．ｎｅｌｓｏｎｉ（Ｔｎｅ）作对照，利用限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）差异对分离自我国黑龙江省３株旋毛虫进行虫种归属鉴定。５种内切酶实验结果显示：黑龙江猪株（ＨＬ）与Ｔｓ酶切图谱相同；犬株（ＷＣ）与Ｔｎ酶谱相同；猫株（ＳＷ）与Ｔｎ的ＤｒａⅠ，ＰｓｔⅠ，ＨａｅⅢ酶谱相近，而与Ｔｎｅ酶谱差异显著。提示：黑龙江猪株系Ｔｓ；犬株系Ｔｎ；猫株在分类归属上似乎与Ｔｎ靠近。

毛细管电泳-限制性片段长度多态性快速检测胃癌组织中P53基因点突变的方法

为建立毛细管电泳快速高效检测小于70bp双链DNA的方法。对毛细管电泳过程中的各参数进行了考察,最终得到最佳分离体系(筛分介质浓度8%,添加剂甘露醇浓度8%,pH6.5,温度15℃,电场强度275V/cm),并将该体系用于临床59例胃癌患者肿瘤组织基因248位、249位密码子点突变情况的检测,30min之内同时检测了两个密码子位点的突变情况,实现了35bp和40bpDNA片段的基线分离,且分离度较高(1.642),初步建立了快速、高分辨诊断胃癌的方法。

用PCR-限制性片段长度多态性分析法检测游泳池肉芽肿中海分枝杆菌

目的:探讨用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析法快速检测游泳池肉芽肿组织中海分枝杆菌。方法:对疑诊为游泳池肉芽肿患者5份皮损组织DNA进行PCR扩增,扩增产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ两种限制性内切酶进行酶切,再用琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并与培养结果进行比较。结果:5份标本中均检测出海分枝杆菌,与培养结果一致。经过3～7个月治疗,4例患者治愈,1例患者好转。结论:用PCR-RFLP可以快速鉴定海分枝杆菌,有利于该类疾病的早期诊断和及时治疗。

家蚕丝素基因pFb2．9限制性片段长度多态性研究

本研究利用丝素Ｈ链基因的结构基因ｐＦｂ２．９为探针，对家蚕基因组ＤＮＡ进行了限制性片段长度多态性分析，并探讨了多态性与茧丝茸毛性状的关系。

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

限制性片段长度多态性分析(ARDRA)方法对重金属污染土壤中细菌群落多样性的研究

限制性片段长度多态性分析(ARDRA)是用限制性内切酶消化扩增后的细菌16SrDNA,通过凝胶电泳分析微生物种群多样性的分子标记技术,该技术在微生物生态学领域有着广泛的应用.实验采用2种途径评价了这种方法应用于研究土壤中细菌种群多样性的可行性.通过对未污染土壤细菌16SrDNA的克隆,获得了经内切酶HaeⅢ消化的不同16SrDNA的ARDRA类型,并对测序的19个克隆子建立了系统发育树.此外,还对不同Cd和Pb污染水平的土壤微生物进行了群落水平上的ARDRA分析.结果表明,5mg·kg-1Cd和500mg·kg-1Pb污染对微生物群落组成有一定影响,但此范围内的重金属含量对微生物群落多样性没有相关性影响.