机械牵张应力刺激成骨细胞的差异蛋白质组学研究

目的应用蛋白质组学方法分析人成骨样细胞Saos-2在牵张应力作用下蛋白质表达的差异,为更全面地阐明成骨细胞对牵张应力的反应机制提供分子基础。方法将Saos-2分为加力组与对照组,采用Flexcell牵张应力加载系统,用12%大小的应力值进行力学刺激24 h后,应用蛋白质双向凝胶电泳分离蛋白样品,质谱技术鉴定差异表达蛋白点,并用生物信息学分析差异蛋白参与的生物学过程和主要功能。结果对照组和加力组分别得到(1031±41)和(928±25)个蛋白质点,质谱鉴定出肽酰脯氨酰异构酶A样3、线粒体ATP合成酶、抗氧化蛋白1、丝切蛋白1、蛋白磷酸酶1、延伸因子2等17个表达增高的差异蛋白质,涉及应激反应、能量代谢、细胞增殖、细胞骨架重建、信号转导及成骨分化等生物学功能。结论成骨细胞在机械牵张应力作用下蛋白表达发生显著变化,这些差异蛋白参与了成骨细胞力学反应机制的不同过程。

机械牵张应力对骨化颈椎后纵韧带成纤维细胞的影响

目的探讨机械牵张应力对体外培养的颈椎后纵韧带骨化症(OPLL)患者颈椎韧带成纤维细胞的影响。方法对2012年1月至2013年12月OPLL与颈椎外伤但无后纵韧带骨化(非OPLL)患者(各15例)行前路颈椎手术治疗,术中取韧带标本。采用组织块培养法进行细胞体外培养,免疫细胞化学及免疫荧光技术检测胞质波形蛋白。采用Flexercell 4000细胞加载培养系统分别对两组患者第3代细胞进行机械牵张应力加载,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测两组成纤维细胞应力刺激前及刺激后12、24 h成骨特异性指标骨钙素、碱性磷酸酶与Ⅰ型胶原mRNA表达。结果免疫细胞化学及免疫荧光检测显示胞质波形蛋白呈阳性表达。OPLL组后纵韧带成纤维细胞经机械牵张应力刺激12 h后,骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA表达明显升高,应力刺激前后差异具有统计学意义;而非OPLL组应力刺激前后骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA表达无明显变化。结论机械牵张应力可促使OPLL患者后纵韧带成纤维细胞骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA表达增加,促进其骨化,其在OPLL进展中发挥重要作用。

机械牵张应力对成骨细胞增殖和分化影响的初步研究

目的:研究不同力值及加力时间的机械牵张应力对成骨细胞增殖和分化能力的影响。方法:采用Flexcell牵张应力加载系统,对成骨样细胞Saos-2进行不同力值、不同时间的刺激,MTT法检测细胞受力后的增殖变化;ALP试剂盒检测细胞受力后ALP活性的变化;半定量RT-PCR检测骨钙蛋白(OC)、骨桥蛋白(OPN)的mRNA的表达;用茜素红染色观察矿化结节形成。结果:当应变值为12%时,力学刺激对成骨样细胞Saos-2增殖以及ALP活性的促进作用最强(P<0.01)。应变值为12%的力学刺激呈时间依赖性明显上调了成骨样细胞Saos-2的增殖、ALP活性以及骨桥蛋白和骨钙蛋白mRNA的表达(P<0.01);牵张应力刺激组较对照组更加容易形成矿化结节。结论:大小适宜的牵张应力可以促进成骨细胞的增殖以及分化指标如ALP活性、骨桥蛋白和骨钙蛋白mRNA的转录水平、矿化结节的形成等,说明机械牵张应力对于成骨细胞的增殖和分化发挥着重要的调控作用。

机械牵张应力对人根尖牙乳头干细胞增殖分化的影响

目的根尖牙乳头干细胞(SCAP)被看作是根尖周组织再生的种子细胞并被用于以干细胞为基础的根尖周组织再生工程中。文章探讨不同力值的机械牵张应力对人SCAP增殖、分化潜能的影响。方法利用组织块酶消化法及有限稀释法分离、培养人SCAP并加以鉴定。根据对细胞加载机械牵张应力大小不同将实验分为150、200、250 g组,另设空白对照组(未做加力处理)。利用MTT法检测不同大小静态机械牵张应力刺激对SCAP增殖活性的影响。利用Western blot检测机械牵张应力作用下SCAP成骨/成牙分化相关蛋白(ALP、OSX、DSP)表达的变化以及不同大小静态机械牵张应力作用下SCAP内质网应激分子伴侣GRP78的表达情况。结果 SCAP细胞经过3周的成骨诱导后进行茜素红染色,镜下可见块状矿化结节的出现,SCAP细胞经过2周的成脂诱导后进行油红O染色,镜下可见红染的脂滴出现。SCAP细胞表面抗原表型通过流式细胞仪检测分析显示:SCAP对CD31(2.46%,内皮细胞标记物)和CD45(0.07%,造血干细胞标记物)呈阴性表达,对CD90(99.89%,间质细胞标记)和STRO-1(15.21%,干细胞标记)呈阳性表达。与150 g组比较,200 g加力组的加载机械牵张应力第2天,SCAP增殖能力明显下降(P<0.05);250 g加力组的加载机械牵张应力的第2、3、4、5天,SCAP增殖能力显著下降(P<0.05)。与200 g组比较,250 g加力组的加载机械牵张应力的第2、3、4、5天,SCAP增殖能力显著下降(P<0.05)。Western blot检测结果显示:加载牵张应力的第5天,与对照组相比,150 g组、200 g组、250 g组成骨分化相关蛋白ALP和OSX和DSP表达均显著升高(P<0.05)。与150 g组相比,200g组ALP、OSX表达差异无统计学意义(P>0.05),DSP表达显著升高(P<0.05);250 g组ALP、OSX、DSP表达均显著降低(P<0.05)。与200 g组相比,250 g组ALP、OSX、DSP表达均显著降低(P<0.05)。Western blot检测显示:加载牵张应力的第5天,与对照组GRP78表达(0.279±0.085)相比,150、200、250 g组GRP78表达(1.085±0.128、1.289±0.076、0.810±0.067)均显著升高(P<0.05)。结论机械牵张应力对人根尖牙乳头干细胞的增殖和成骨/成牙本质分化具有调控作用。内质网应激参与了机械牵张应力作用下的SCAP成骨/成牙分化过程,并促进了SCAP成骨/成牙分化。

mTOR与NF-κB的交互在机械牵张应力刺激成骨细胞分化过程中的作用及机制研究

目的机械力能促进成骨细胞分化,但机制仍未系统阐明。最近研究发现,mTOR和NF-κB(Akt的两个下游分子)之间存在交互作用,在肿瘤细胞活性调节中发挥重要作用。探讨mTOR和NF-κB交互在机械牵张力维持成骨细胞稳态中的作用。方法对体外成骨细胞施加机械牵张力,观察细胞形态、成骨分化及矿化的改变。使用抑制剂或siRNA分别或联合阻断mTOR和NF-κB信号,观察对比成骨因子表达变化。结果机械牵张应力刺激使成骨细胞成线性排列。

牵张应力对人牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响及其信号转导途径研究

目的研究不同强度机械牵张应力对人牙周膜细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)及其组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响,并探讨机械牵张应力作用下人牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1表达变化的信号转导途径。方法通过细胞牵张应力加载系统对体外培养的人牙周膜细胞同时施加0%、6%、12%和18%形变率的机械牵张应力,作用24 h后,用RT-PCR方法检测细胞受力后MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的变化,用免疫印迹法检测其蛋白表达的变化。另外,通过使用不同信号途径的特异性抑制剂,用RT-PCR方法分别检测不同抑制剂对牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的变化。结果人牙周膜细胞受力后,MMP-13/TIMP-1 mRNA及蛋白表达随牵张应力强度的增大明显增加。PD098059可抑制机械牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-13 mRNA表达的增加。放线菌酮可抑制机械牵张应力作用下TIMP-1 mRNA表达的增加。结论不同强度机械牵张应力可以影响人牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1的表达,进而影响牙周组织细胞外基质代谢。机械牵张应力作用下MMP-13表达的增加是通过ERK-MAPK途径。机械牵张应力作用下TIMP-1表达的增加是通过新生蛋白途径。

牵张应力下Cofilin在成骨细胞中表达变化的实验研究

目的:观察机械牵张应力作用下人成骨肉瘤细胞MG-63中丝切蛋白(Cofilin)的表达。方法:将MG-63细胞分为加力组与对照组(不加力),加力组采用Flexcell牵张应力加载系统,用12%变形率的应力值进行力学刺激1、4、8、12、24 h,用免疫荧光染色观察Cofilin的变化,RT-PCR检测Cofilin mRNA水平含量的变化,Western-Blot测定细胞内Cofilin蛋白含量。结果:MG-63细胞受应力刺激后1、4 h细胞内Cofilin染色逐渐增强,8、12、24 h细胞染色逐渐减弱,但仍高于对照组。应力作用下Cofilin mRNA水平无明显变化(P>0.05)。Western Blot显示,加载后1 h细胞内Cofilin含量增高(P<0.05),4 h时达到高峰(P<0.05),8、12、24 h后Cofilin含量逐渐减少,但仍高于对照组(P<0.05)。结论:机械牵张应力刺激可明显上调Cofi-lin在MG-63细胞中表达,且具有时间依赖性,提示其可能在成骨细胞力学信号转导过程中发挥重要作用。

Piezo1蛋白在人退变软骨细胞应力模型中的表达特点

目的:探索新型机械敏感性离子通道Piezo1蛋白在人退变软骨细胞应力模型中的表达特点。方法:构建人退变软骨细胞体外培养-应力刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统FX-4000T处理软骨细胞,根据预试验结果加载0.5 Hz的加载频率和20%的细胞拉伸率。按细胞的处理时间分成0 h,2 h,12 h,24 h和48 h机械应力组。采用RT-PCR技术,Western-blot检测Piezo1蛋白在周期性牵张应力作用下的表达水平。利用激光共聚焦显微镜检测Piezo1蛋白荧光的强弱。结果:(1)RT-PCR结果显示,2 h牵张应力组Piezo1的基因相对表达量较0 h牵张应力组增加(F=13.917,q=0.037 1,P<0.05),24 h牵张应力组Piezo1基因相对表达量达峰值,而48 h牵张应力组Piezo1基因相对表达量较24 h牵张应力组降低,差异有统计学意义(F=13.917,q=0.049 5,P<0.05)。(2)Western-blot结果显示,2 h牵张应力组Piezo1的蛋白表达量较空白对照组(0 h牵张应力组)略有增加(F=19.341,q=0.037 1,P<0.05),24 h牵张应力组的Piezo1蛋白的表达量最多,而48 h牵张应力组的Piezo1蛋白表达量较24 h牵张应力组降低(F=19.341,q=0.017 7,P<0.05)。(3)Piezo1蛋白表达于髓核细胞的细胞质与细胞核,并且随着加力时间的增加,蛋白的荧光强度也有相应的增加。结论:在人类退变软骨细胞中,新型机械敏感性离子通道Piezo1蛋白有微量表达,加载周期性机械拉伸力后,Piezo1蛋白的表达量增多,并且呈现时间依赖性。

牵张应力对成骨肉瘤细胞MG-63中RhoA和ROCK表达的影响

目的:探索机械牵张应力对人成骨肉瘤细胞MG-63中RhoA/ROCK信号通路的影响。方法:将同一条件培养的细胞MG-63分为实验组(加力)与对照组(不加力),实验组采用Flexcell牵张应力加载系统,选择12%形变率作为加载应力值,分为五个时间组,分别加载1 h,4 h,8 h,12 h,24 h,RT-PCR检测RhoA、ROCK mRNA水平表达的变化,Western-Blot检测RhoA与Rock蛋白含量变化。结果:RT-PCR显示MG-63细胞受应力刺激后1 h RhoA、ROCK均未见明显变化(P>0.05),4小时后略有升高(P<0.05),在8 h达到最大值(P<0.05),12、24 h降低,但仍高于对照组(P<0.05);Western-Blot显示MG-63细胞受应力刺激后1 h RhoA、ROCK均未见明显变化,4 h仍未见明显变化,在8 h达到最大值,12、24 h降低,高于对照组。结论:机械牵张力加载下MG-63细胞内RhoA、ROCK表达升高并随时间增加出现峰值,提示其可能在成骨细胞力学信号转导过程中发挥重要作用。

siRNA-Piezo1通过ERK1/2信号通路抑制滑膜细胞增殖和炎性因子表达的相关机制

目的:探究siRNA-Piezo1通过抑制Piezo1表达、阻断ERK1/2信号通路后,对滑膜细胞增殖情况和炎性因子表达的影响及相关机制.方法:以类风湿关节炎(RA)患者和截肢患者为研究对象,手术过程中获取滑膜组织.利用免疫组化染色法检测滑膜组织中Piezo1蛋白的表达量.分离并培养人关节炎成纤维样滑膜细胞(RAFLS),通过Flexcell 4000 T设备构建体外力学RAFLS细胞模型,根据干预情况分成空白对照组,siRNA-Piezo1组、siRNA-Piezo1+PD98059组、24 h应力组、siRNA-Piezo1+24 h应力组、siRNA-Piezo1+PD98059+24 h应力组、48 h应力组、siRNA-Piezo1+48 h应力组和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h应力组.RT-PCR方法检测Piezo1和EKR1/2的变化,CCK-8试剂盒检测增殖情况,ELISA方法观察关节液和细胞上清液中白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达.结果:免疫组化的结果显示,RA患者滑膜组织中Piezo1蛋白的表达量要明显高于正常对照者(P<0.05).荧光显微镜下观察,慢病毒转染RAFLS的效率大于90%,RT-PCR结果显示,siRNA-Piezo1干扰序列转染RAFLS后,Piezo1 mRNA的表达量明显降低(P<0.05).CCK-8测定结果显示,24 h应力组和48 h应力组RAFLS细胞的增殖率均明显高于空白对照组(P<0.05);siRNA-Piezo1+24 h应力组和siRNA-Piezo1+48 h应力组RAFLS细胞的增殖率分别明显低于24 h应力组和48 h应力组(P<0.05);siRNA-Piezo1+PD98059+24 h应力组和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h应力组RAFLS的细胞增殖率分别明显低于24 h应力组和48 h应力组(P<0.05)及siRNA-Piezo1+24 h应力组和siRNA-Piezo1+48 h应力组(P<0.05).ELISA测定结果显示,24 h应力组和48 h应力组细胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量均明显高于空白对照组(P<0.05);siRNA-Piezo1+24 h应力组和siRNA-Piezo1+48 h应力组细胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量分别明显低于24 h应力组和48 h应力组(P<0.05);siRNA-Piezo1+PD98059+24 h应力组和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h应力组细胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量分别明显低于siRNA-Piezo1+24 h应力组和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h应力组(P<0.05).RT-PCR测定结果显示,24 h应力组和48 h应力组细胞Piezo1和ERK1/2的mRNA的相对表达量均明显高于空白对照组(P<0.05);siRNA-Piezo1+PD98059+24 h应力组和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h应力组细胞ERK1/2的mRNA的相对表达量分别明显低于siRNA-Piezo1+24 h应力组和siRNA-Piezo1+48 h应力组(P<0.05).结论:ERK1/2可能为Piezo1的下游信号分子,通过ERK1/2信号通路阻断力学信号传导,可抑制RAFLS细胞增殖和炎性因子的释放.

力学信号与细胞适应

人体是由骨骼和肌肉等运动系统构成的有生命活动的机体,与内外力学刺激信号密切关联。力学刺激信号传递至组织细胞,并与细胞内部生物学信号交互作用,从而完成生物学过程。人体响应的力学刺激主要有机械牵张应力、流体剪切应力与静水压力等。阐明力学信号下细胞的变化及机制,对于生命科学具有十分重要的意义。本文将主要针对机械牵张应力、流体剪切应力与静水压力这三种力学信号的体外力学加载装置及其引起的细胞适应作一综述。