杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因检测专家共识

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因家族具有复杂的遗传多态性,既有等位基因水平的多态性,同时还存在KIR单体型组成、基因拷贝数的差异性。为了规范KIR基因检测,中国输血协会人类组织抗原专业委员会与深圳市血液中心组织专家依据国内外文献和实践经验,制定了此专家共识,对KIR基因多态性检测方法、质量控制、检测报告和应用等进行了阐述,旨在提高KIR基因检测的准确性。

共抑制受体T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域免疫抑制机制的研究进展

恶性肿瘤的发生、发展与免疫检查点受体有紧密联系,肿瘤细胞可以通过激活免疫检查点来逃避免疫监视。T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(TIGIT)是一种在免疫细胞上表达的抑制性受体。TIGIT可以通过多种机制抑制T细胞和天然杀伤(NK)细胞等免疫细胞的功能,使肿瘤细胞逃避免疫系统的监视,本文将对TIGIT的免疫抑制机制研究进展进行系统综述。

血清白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B2水平在结直肠癌患者中的诊断价值

目的探讨白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B2(LILRB2)水平在结直肠癌(CRC)患者中的诊断价值。方法选取2021年1月至2022年5月于潍坊医学院附属医院(以下简称“我院”)确诊的CRC患者125例为CRC组,筛选同期于我院进行健康检查人群120名为对照组。采用酶联免疫吸附试验法及电化学发光法分别检测CRC组和对照组血清LILRB2、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)水平。对所得数据进行统计学处理,分析LILRB2在CRC患者中的诊断价值。结果CRC组血清LILRB2、CA199、CEA水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、淋巴结转移、脉管癌栓、浸润深度、TNM分期患者血清LILRB2水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。受试操作特征曲线结果显示,血清LILRB2、CA199、CEA及三者联合检测的曲线下面积分别为0.7593、0.5727、0.7234、0.7889;三者联合检测的诊断效能高于CA199、CEA单独检测,差异有统计学意义(P<0.05);而其与LILRB2比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TNMⅠ+Ⅱ期患者的LILRB2诊断敏感度高于TNMⅢ+Ⅳ期,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CRC患者血清LILRB2水平对CRC诊断具有一定的临床价值。

川崎病患儿治疗前后抗体分泌细胞和免疫球蛋白样受体水平的变化

目的:探讨川崎病(KD)患儿B细胞亚群特异性抗体分泌细胞(ASC)、免疫球蛋白样受体(LILR)表达特征。方法:选取我院2018年1月至2021年3月收治的急性期KD患儿32例为观察组及体检健康儿童19例为对照组。其中11例KD患儿(类固醇组)Egami评分>3分,预测可能存在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)无反应,采用类固醇药物治疗,其余21例患儿(IVIG组)均给予IVIG治疗,比较对照组与观察组治疗前后CD19^(+)B细胞群中ASC、白细胞LILR表达情况。结果:观察组KD患儿外周血单核细胞(PBMC)水平、B细胞亚群中ASC水平高于对照组(P<0.05)。IVIG组及类固醇组患儿治疗后PBMC水平、PBMC中CD4^(+) T细胞、CD8^(+)T细胞水平均高于治疗前(P<0.05),ASC水平低于治疗前(P<0.05),且类固醇组ASC占比低于IVIG组(P<0.05)。流式细胞术检查显示,4种抑制性LILR亚型在单核细胞上表达,LILRB1在每个B细胞亚群上表达,而LILRB2或LILRB3在B细胞亚群上的表达在急性期和治疗后均较少;LILRB4在ASC上呈现唯一表达,其急性期水平低于单核细胞;观察组ASC的LILRB1、LILRB4水平高于对照组,且治疗后低于治疗前(P<0.05)。结论:KD患儿急性期ASC呈升高趋势且富含LILRB4表达,治疗结果不受类固醇给药影响。ASC可能在KD发生发展过程中发挥着重要作用。

浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究

本研究的目的是分析浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的多态性及基因型。采用序列特异性引物PCR法(PCRSSP)进行KIR基因低分辨率检测和基因型分析。结果表明:①在浙江汉族人群中共检出目前已知的17个KIR基因。2DL4、3DL2和3DL3基因存在于所有个体,其基因频率为1.00。2DL1、2DL3、2DP1、3DP1003、3DL1、2DS4001/002基因较为常见,频率分别为0.902、0.902、0.902、0.902、0.7598、0.5615;而2DL2、2DL5A、2DL5B、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4003、2DS5、3DS1和3DP1001/002基因频率较低。②浙江汉族人群中以A型单倍型为主,频率高达74.7%。在检测样本中共明确检出12种单倍型,最常见的是单倍型2,频率为53.0%。③共检出26种基因型,最常见为AJ(2,2)、AF(1,2)型,其次为AH(2,5)、NN2(2,6)、AI(1,5)和AG(1,1)。其中有15种基因型在白人中尚未见报道,4种基因型无法根据相关文献标准分析出单倍型。结论:浙江汉族人群有其独特的KIR基因频率和基因型频率分布。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其配体HLA-C基因多态性与不明原因早期复发性流产的相关性

目的:探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其配体HLA-C基因多态性与不明原因早期复发性流产易感性的关系。方法:留取不明原因早期复发性流产患者(38例,URSA组)及正常早孕妇女(35例,对照组)的蜕膜、绒毛组织,抽提基因组DNA,序列特异性引物聚合酶链反应检测蜕膜组织14种KIR基因的表达;DNA测序法分析绒毛滋养细胞HLA-C1、HLA-C2基因多态性。结果:14种KIR基因均以不同频率表达;KIR2DS1基因的频率在URSA组与对照组中分别为60.27%vs41.18%,两组相比,差异有显著性(P=0.03)。两组基因HLA-C1、HLA-C2在绒毛组织中呈不平衡表达,以HLA-C1基因占明显优势。URSA组与对照组HLA-C1基因频率分别为66.67%、81.03%,两组相比差异无显著性,P=0.657;URSA组HLA-C2的基因频率为33.33%,对照组HLA-C2的基因频率为19.07%,两组相比差异有显著性,P=0.007。结论:蜕膜NK细胞活化性KIR基因频率升高,与绒毛滋养细胞的HLA-C2基因结合,传递活化性信号活化NK细胞,可能是引起URSA发病的免疫遗传学因素之一。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与强直性脊柱炎的关联性

目的:探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunogloblin-like receptors,KIRs)基因多态性与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)的关联性。方法:采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法,分析86例AS患者和412例无血缘关系的正常人中迄今发现的14个KIR基因和假基因KIRZ的基因频率、基因型和单倍型。结果:AS患者组活化型KIR3DS1、抑制型KIR2DL2和KIR2DL5的基因频率较对照组显著升高(P<0.05);携带2个或2个以上活化型KIR基因的AS患者明显高于对照人群;其余各KIR的基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:活化性/抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的失衡可能与AS的发生相关。

桥本甲状腺炎患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体与人类白细胞抗原基因对频率的分析

目的:探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Kill cell immunoglobulin-like receptor,KIR)与人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)组成的受体-配体基因对与桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)的关联性。方法:选择散发HT患者44例和健康对照43例,提取全血基因组DNA,序列特异性引物聚合酶链反应检测4个KIR基因和8个HLA-C基因,根据受体-配体特异识别原则组成KIR2DL1+HLA-C2、KIR2DL2/2DL3+HLA-C1、KIR2DS1+HLA-C2和KIR2DS2+HLA-C1共4对KIR/HLA-C基因对,分析各基因对频率在两组人群中的差别。结果:活化性KIR2DS2+HLA-C1基因对在HT患者组与对照组频率差异有显著性(36.36%vs 16.28%,P<0.05)。其余基因对在两组间未见明显差异。结论:HT患者活化性KIR/HLA-C基因对频率升高,传递活化性信号活化NK细胞和T细胞,可能是HT发病的免疫遗传学因素之一。

江苏地区汉族献血员杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究

目的分析江苏地区汉族献血员杀伤细胞免疫球蛋白样受体(K IR)基因多态性、基因型及单倍型,为研究K IR基因与疾病相关性提供依据。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)对江苏地区163名汉族献血员进行K IR基因低分辨率检测和基因型、单倍型分析。结果共检出除框架基因及假基因外的12个K IR基因,其中2DL1和2DL3存在于所有个体,3DL1和2DS4较为常见;其次为1D、2DL5、2DS1、3DS1及2DS5;2DS2、2DL2及2DS3基因频率较低;检出的17种基因型中,以AJ(2,2)和AF(1,2)型最为常见,其次为AH(5,2)和AG(1,1)型。有3种基因型(New1、New11及New19)在白人中未见报道,其中New19国内未见报道;163例个体中明确检出9种单倍型,最常见的是单倍型2,其次是单倍型1。结论江苏地区汉族人群有其独特的K IR基因频率、基因型频率和单倍型频率分布,并有可能存在新的基因型和单倍型。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多样性与中国南方汉族人群鼻咽癌相关性的研究

本研究探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多样性与中国南方汉族人群鼻咽癌的相关性。采用序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)方法,对67名临床诊断为鼻咽癌(NPC)的南方汉族患者的血样和77例随机健康对照组血样进行KIR基因定型,并采用Wolf法计算相对危险度值。结果表明,与对照组相比KIR2DL3基因频率在患者组显著降低(χ2>3.84,p<0.05,RR=0.08),具有统计学差异;KIR2DS5和KIR2DL5B基因频率在患者组显著升高(χ2>3.84,p<0.05,RR值均>1),具有统计学差异,而其它各KIR基因频率差异无统计学意义。结论 :南方汉族人群NPC患者中KIR2DL3、KIR2DS5和KIR2DL5B基因可能与NPC发病相关。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因及其配体相合或错配对单倍相合骨髓移植效果的影响(英文)

本研究分析杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell Ig-like receptor,KIR)及其配体分子相合与否对单倍体相合骨髓移植效果的影响。分析了74例KIR基因及其配体分子HLA-Cw的分布频率和特点,同时比较KIR分子配体缺失与否对单倍相合骨髓移植患者总体生存、无病生存、GVHD发生以及复发等的影响。结果表明:19个KIR基因表型中2DL1、2DL4和3DL2-3在所有个体100%分布,其他高频率分布的还有3DP1(98.6%)、2DP1(98.6%)、3DL1(97.3%)、2DL3(97.3%);抑制型基因分布频次是活化型的1.37倍;所有单倍体都含有2DL1、KIR3DL2、3DL3和2DL4,其中每个单倍体中均含有2DL2和/或2DL3。HLA-C14个等位基因中Cw7分布频率最高为37.8%;KIR2DL2/2DL3识别配体Group2(HLA-Cw1,3,7,8,13,14)组占43.2%。32例单倍相合骨髓移植中KIR基因错配发生比例为43.8%,其中9/14例为2DL不相合、5/14为2DL2或3DL1不相合;46对单倍相合骨髓移植中HLA-Cw全相合者29例,不相合者14例,HLA-Cw发生完全错配比例为30.4%,全相合比例为63.4%。14例KIR基因不相合和13例KIR基因相合移植病例中,KIR基因相合组生存率高于KIR基因不相合者(p=0.032);17例KIR分子配体HLA-Cw不相合移植患者的DFS明显高于24例相合者(p=0.024)。按供受者KIR配体是缺失的GVHD矢量组生存率高于非GVHD矢量组(p=0.015)。急性重症GVHD发生与活化型KIR2DS1/2DS2有关,2DS1/2DS2不相合组高发急性重症GVHD同时复发减低,而2DS1/2DS2相合组低GVHD但是复发增多。14例KIR配体不相合髓系白血病患者骨髓移植后1例复发死亡,而12例KIR配体相合组患者有4例复发死亡。结论:单倍体相合骨髓移植的主要特点就是HLA不全相合,KIR基因表型不一致性及其配体缺失也是其主要免疫学特征,供者型KIR配体的缺失与移植效果有密切关系,在单倍相合移植中分析KIR基因及其配体对于供者选择和判断预后有重要意义。

中国江苏地区汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的多态性

本研究探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)在江苏汉族人群中的分布规律。用PCR-SSP方法对江苏地区269名汉族非亲缘健康人群行KIR基因分型。结果表明:在江苏人群中检出了目前已知的所有KIR基因,共发现江苏汉族人群KIR基因型34种;15种基因型在浙江和香港人群中亦有报道(AA1、BX2、BX3、BX4、BX5、BX6、BX8、BX9、BX11、BX13、BX33、BX68、BX69、BX70、BX75);19种基因型未见于浙江和香港人群(BX10、BX12、BX17、BX23、BX26、BX27、BX28、BX31、BX35、BX42、BX47、BX57、BX72、BX74、BX79、BX154、BX188、BX231、BX370)。在江苏汉族人群中发现仅在希腊人群中罕见的基因型BX42和仅在瑞典人群罕见的基因型BX231,及仅在马其顿人群中罕见的基因型BX370。结论:在江苏汉族人群中检出了目前已知的所有的16个KIR基因,总计发现了KIR基因型34种,其中BX42、BX231和BX370是罕见的KIR基因型。

蜕膜杀伤细胞免疫球蛋白样受体谱表达与原因不明性流产的关系

目的:探讨蜕膜中杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)谱表达对妊娠结局的影响。方法:将95例自然或人工流产者分为3组:组1包括41例正常早孕人流妇女;组2包括16例原因不明的习惯性流产妇女;组3包括38例原因不明的1次自然流产妇女。用PCR-SSP方法检测蜕膜中KIR谱的表达。结果:组2蜕膜中KIR2DL2基因表达比组1明显增加(P<0·05),与组3无明显差异,而KIR3DL1基因表达比组1及组3明显下降(P<0·01);组2蜕膜KIR2DS5基因表达比组3明显增加(P<0·05),但与组1无明显差异。组3蜕膜中KIR2DL3和KIR2DS5基因表达分别比组1明显下降(P均<0·05),而KIR2DL3基因与组2无明显差异(P>0·05)。所有自然流产患者(组2+组3)蜕膜中的KIR2DL3和KIR3DL1基因表达与正常早孕组(组1)比较均明显下降(P<0·05,P<0·01)。结论:子宫蜕膜的KIR谱表达异常在导致妊娠失败的病理生理中起重要作用。

Graves病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因型分析

目的:探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因型在Graves病(GD)患者中的分布规律。方法:采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)的方法,分析96例Graves病患者和96例正常对照人群的KIR基因型。结果:GD患者中2DS2-,2DL2-,2DL3+,2DL1+,3DL1+,3DS1-,2DL5-,2DS3-,2DS5-,2DS1-,2DS4-基因型频率高于对照组(6.25%vs0,P<0.05);对照组中,基因频率最高的基因型为2DS2-,2DL2-,2DL3+,2DL1+,3DL1+,3DS1-,2DL5-,2DS3-,2DS5-,2DS1-,2DS4+,该基因型的基因型频率较GD患者组高,且有显著性差异(28.13%vs10.42%,P<0.01);GD患者组不携带活化性KIR基因的基因型频率较对照组明显升高(10.42%vs0%,P=0.001)。结论:KIR基因型在GD患者与正常人群分布的差异可能与GD的发病有关。

江苏汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其特异性配体HLA分析

目的:分析杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)及其特异性配体HLAⅠ类分子在江苏地区汉族人群的分布特点。方法:分别利用real-time PCR法和PCR-SSP方法对173例无血缘关系的江苏汉族健康人群进行KIR和HLA-Cw,HLA-Bw4分型,并分析KIR/HLA配对组合的类型和数量。结果:江苏汉族人群中,>92%的个体同时表达四种抑制性KIR(iKIR)(2DL1,2DL2/3,3DL1,3DL2)。2DL2/HLA-C1,2DL3/HLA-C1,2DL1/HLA-C2,3DL1/Bw4的频率分别依次分别为0.243,0.971,0.457,0.590;2DS1/HLA-C2,2DS2/HLA-C1的频率为0.162,0.231。54.3%的个体只表达2DL1而不表达相应的配体HLA-C2,32.9%的个体只表达3DL1而缺乏配体HLA-Bw4,另有5.8%的个体只表达HLA-Bw4而不表达3DL1。27.7%的个体同时表达3种iKIR/HLA,26%的个体同时表达两种iKIR/HLA,25.4%的个体只遗传一个iKIR/HLA配对,未发现3种iKIR/HLA同时缺失的个体。结论:在江苏汉族人群中,存在KIR与HLA表型分离现象,抑制性KIR/HLA配对表达高于刺激性KIR/HLA配对,约1/4个体只表达单个iKIR/HLA配对。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其配体对亲缘供者造血干细胞移植预后的影响

目的检测杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)及其配体-人类白细胞抗原Ⅰ(HLAⅠ-)基因分布频率,评估两者的相互作用对亲缘供者造血干细胞移植(HSCT)预后的影响。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)检测87对亲缘供者HSCT供受者(半倍体相合40对,同胞完全相合47对)的HLA-Cw及供者KIR基因型。结果87例正常供者均携带抑制型KIR2DL1、2DL2/L3、2DL4、3DL2和3DL3,基因频率为1;其次是3DL1,基因频率为96.6%;激活型KIR基因频率不一。87例受者的C1表达率为97.7%,而C2、Bw4、HLA-A3/A11的表达率不一。半倍体相合HSCT中KIR-HLA配体不合34例,相合6例;HLA-HLA配体相合31例,不合9例。同胞完全相合HSCT中KIR-HLA配体不合42例,相合5例。KIR-HLA配体不合组移植后2年无病生存率为(71.5±6.5)%,明显高于相合组的(50.0±10.7)%(P<0.05)。结论激活型KIR的基因频率明显低于抑制型KIR基因频率,抑制型KIR2DL1、3DL1、3DL2可能对NK细胞同种反应性起主要作用。KIR-HLA配体不合亲缘供者HSCT患者的无病生存率明显高于KIR-HLA配体相合者。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与原发性胆汁性肝硬化的相关性分析

目的探讨江苏汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多态性与原发性胆汁性肝硬化(PBC)的相关性。方法收集2011-06-01/2013-07-31期间江苏省常州三院住院的PBC患者122例和198例相匹配的无血缘关系健康人群外周血标本。采用实时荧光定量PCR检测KIR基因多态性,分析KIR基因及基因型频率在2组人群间的差异。结果 PBC患者KIR2DL2和2DS2基因频率比对照组显著性降低,与降低疾病的患病风险有关。共检测出55种KIR基因型,其中PBC组24种,对照组47种。最常见的基因型为AA1,其次为BX2、BX8、BX4、BX14。对存在于5个或以上个体的11个基因型进行分析,未发现PBC组与对照组之间有显著性差异。结论 KIR2DL2和2DS2的缺失可能是江苏地区汉族人群PBC发病潜在的保护因子。

HLA相合亲缘供受者自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的分析

本研究分析HLA相合亲缘关系供受者自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因分布情况并探讨其KIR相合的可能性。采用Luminex流式技术和测序方法检测HLA-A,-B,-Cw和-DRB1位点;利用序列特异性引物PCR法(PCR-SSP)检测KIR基因。结果表明:在HLA-A,-B,-Cw和-DRB1等8个位点相合的27对亲缘关系供受者样本中检出17个KIR基因,其中KIR3DL3、KIR3DP1、KIR2DL4和KIR3DL2基因存在于所有个体;检出20种KIR基因型和12种单倍体,常见基因型为2,2,频率为29.6%;最常见单倍体是2,频率为53.0%,样本以A型单倍体为主,频率为67.2%;12对(44.4%)供者KIR与受者KIR基因型和单倍体完全相同,13对(48.1%)供者KIR与受者KIR存在1个单倍体相同,2对(7.4%)供者KIR与受者KIR基因型和单倍体完全不同;1对供者KIR2DL1与受者HLA-Cw(Lys80)配基完全相合,17对供者KIR2DL2/2DL3与受者HLA-Cw(Asn80)配基完全相合,5对供者KIR3DL1与受者HLA-B(Bw4)配基完全相合。结论:HLA相合亲缘关系供受者KIR匹配的错配率比较高。

白血病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多态性分析

目的:探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因型与白血病发病之间的关系.方法:采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法对263例白血病患者和239例健康正常对照的KIR基因多态性进行检测,比较KIR基因型频率在白血病患者和健康正常对照之间、不同白血病类型之间的差异.结果:263名白血病患者和239名正常对照中KIR2DL4,3DL2,3DL3,3DP1的基因频率均为1.000.其中KIR2DL1,2DL3,3DL,2DP1基因频率较高,而2DL5B基因频率较低.白血病患者和正常对照中KIR2DS4基因频率分别为0.5101,0.3901,2组组间差异具有统计学意义(P<0.01),其余基因频率2组组间差异均无显著性.慢性粒细胞白血病(CML)、急性非淋巴细胞白血病(NALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)3组患者中,KIR2DS4基因频率分别为0.6050,0.4017,0.4569;CML组KIR2DS4频率明显高于NALL,ALL组和正常对照组(P<0.05);NALL,ALL组与正常对照组之间KIR2DS4频率差异无显著性.CML,NALL,ALL组中其余基因频率差异均无统计学意义.结论:激活型KIR2DS4可能与慢性粒细胞白血病发病有一定的关联.

巨细胞病毒感染患儿杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性分析

目的探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多态性与人巨细胞病毒(HCMV)感染是否存在关联。方法采用PCR序列特异性引物(PCR-SSP)方法检测76例巨细胞病毒感染患儿和96例正常对照的KIR基因的多态性。结果患儿组KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS5基因频率显著高于健康对照组(χ2=9.145,P=0.002;χ2=15.167,P=0.000;χ2=4.611,P=0.032);其余各KIR基因频率与对照组比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。具有3个或3个以上活化性KIR基因的个体在患儿组中占63.16%,在对照组中占32.29%,差异有统计学意义(χ2=16.273,P=0.000)。结论 KIR基因多态性与HCMV感染有关联,活化性KIR基因数目增多可能是HCMV感染后发病的遗传因素之一。