杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种胞外产物毒性及免疫原性分析

用玻璃纸平板法提取了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Aeromonassal monicida masoucida的胞外产物(ECP)。毒性试验证实,ECP对剑尾鱼Xiphophorus helleri具有致死性,其半致死量(LD50)为4.72μg蛋白/g体重。SDS-PAGE表明,ECP由13条蛋白带组成。利用大鼠抗ECP血清进行的Western-blot印迹显示,组成ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性,能够引发机体的免疫应答反应产生抗体,其分子量分别为88、70、42、39、36、22和15kDa。

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp.masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5μL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法,该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑。

绿鳍马面鲀与许氏平鲉杀鲑气单胞菌病原的分离和鉴定

2018年和2019年,山东省烟台市蓬莱市一养殖场工厂化养殖的绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)和许氏平鲉(Sebastes schlegeli)发病死亡,主要症状为嘴部溃疡、红肿和出血。从发病鱼内脏中均可分离到大量形态一致的优势菌,分别命名为2018TS-1和2019SS-1,分离菌株经16S rRNA测序、生理生化鉴定和vap A基因分析确定为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp. masoucida)。人工感染结果显示,2018TS-1和2019SS-1分别能引起绿鳍马面鲀和许氏平鲉的死亡,被感染鱼呈嘴部红肿症状,与自然发病症状一致,其半数致死量分别为1.78×10^(5)和0.89×10^(5) CFU/尾。本研究首次报道了国内工厂化养殖绿鳍马面鲀和许氏平鲉感染杀鲑气单胞菌的病例,是目前人工养殖绿鳍马面鲀的首个疾病报道,也是继大西洋鲑(Salmo salar)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)等品种后,在山东省海水养殖鱼类中再次发现杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染。本研究结果丰富了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染宿主范围,也为绿鳍马面鲀和许氏平鲉养殖的病害防控提供依据。

一株大菱鲆源杀鲑气单胞菌非典型株的分离鉴定及毒力基因型

为研究大菱鲆Scophthalmus maximus杀鲑气单胞菌非典型株的特性,利用常规病原菌分离方法,从某养殖场患病个体脾脏分离纯化获得一株优势菌BHAS-1,通过生理生化鉴定、序列比对、回归感染、毒力基因检测和药敏试验等对其开展研究。结果表明:分离株BHAS-1为无运动能力、β溶血的革兰氏阴性杆菌,与杀鲑气单胞菌非典型株具有相似的生理生化特性,但该分离株不产生吲哚,不能利用甘露糖;对菌株开展16S rRNA、gyrB、vapA基因扩增和序列比对,基于vapA基因构建的系统进化关系中,分离株BHAS-1与Aeromonas salmonicida subsp.masoucida RZ6S-1及ATCC 27013T单独聚为一支,结合生理生化鉴定结果,判定分离株为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种A.salmonicida subsp.masoucida;菌株BHAS-1对大菱鲆的半致死浓度(LD)为1.62×10^(8)CFU/mL,毒力基因型为aer^(+)-zot^(+)-dna^(+)-ser^(+)-lip^(+)-sp^(+)-alt^(+)-act^(+)-ast^(+)-epa^(+)-fla^(+)-ahyB^(+);菌株BHAS-1对恩诺沙星、四环素等7类13种抗生素敏感,对复方新诺明、氯霉素等6类7种抗生素耐药,耐药率为31.82%。研究表明,应用vapA基因可以有效鉴别杀鲑气单胞菌不同亚种。

大菱鲆红嘴溃疡病病原菌的生物学特性研究

为研究大菱鲆红嘴溃疡病病原菌生物学特性，从养殖场患病大菱鲆的溃疡处、肝脏、脾脏和肾脏中均分离到一株优势菌，命名WB0826，该菌株在TSA琼脂平板上生长呈表面光滑、边缘整齐、稍微隆起的圆形白色菌落，直径约1mm左右。用腹腔注射和浸泡法进行人工感染试验，结果显示，人工感染大菱鲆出现部分体表溃疡、肝脏充血、肠道充水等与病鱼相似症状，表明菌株WB0826对大菱鲆有较强的致病性，可以引起养殖大菱鲆发生红嘴溃疡病；16SrDNA基因组测序、生理生化鉴定结果显示，该菌与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种（Aeromonass Mmonicida subsp．masoucida）相似度最高，综合WB0826菌株各项生理学特征和基因组测序结果，将其鉴定为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种。