IL-15转染人CIK细胞对HT-29的杀瘤效果探究

目的探讨白细胞介素15(IL-15)基因(IL-15)转染人细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞对HT-29[人结肠癌(CRC)细胞株]的杀瘤效应。方法从血液样本制备CIK细胞后,用含IL-15的慢病毒感染CIK细胞,制备转基因CIK细胞(IL-15-CIK细胞)。将IL-15-CIK细胞、CIK细胞分别与HT-29细胞共培养,按效靶比5︰1、10︰1、20︰1、25∶1培养14 d。分别评估IL-15-CIK细胞、CIK细胞对HT-29细胞的IL-15、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量变化和杀瘤效应。结果成功制备CIK细胞及IL-15-CIK细胞。效靶比25∶1,IL-15-CIK细胞与CIK细胞对CRC细胞的杀伤最高(72.56%±5.66%、52.33%±3.46%),且两种细胞差异有统计学意义(P<0.05)。即IL-15-CIK细胞对HT-29细胞的杀伤能力强于CIK细胞。在IL-15-CIK细胞及CIK细胞培养7 d、11 d、14 d中,两种细胞上清液中IL-15、IFN-γ及TNF-α的含量均随着时间的增加而升高,杀瘤后任何两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05);但在IL-15-CIK细胞中观察到,TNF-α含量在11 d与14 d内差异无统计学意义(P>0.05),其余时间相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-15-CIK细胞及CIK细胞以E∶T=25∶1对HT-29细胞株作用后,检测到两种细胞上清液中IL-15、TNF-α、IFN-γ含量较作用前含量增加[IL-15-CIK细胞:IL-15(45.37±2.15)pg/mL vs(35.49±1.09)pg/mL,TNF-α(34.83±1.63)pg/mL vs(28.04±0.41)pg/mL,IFN-γ(42.34±1.50)pg/mL vs(26.08±0.57)pg/mL。CIK细胞:IL-15(21.18±0.76)pg/mL vs(20.34±1.07)pg/mL,TNF-α(20.04±3.03)pg/mL vs(18.04±0.27)pg/mL,IFN-γ(23.90±1.33)pg/mL vs(19.06±0.34)pg/mL]。结论IL-15-CIK细胞对CRC细胞株的杀伤能力较CIK细胞强,应用IL-15转染人CIK细胞可增强CIK细胞杀瘤效应。

人 TNF-α 分泌型、膜型和膜稳定型重组体的构建、表达及杀瘤效应研究

通过用ＩＬ－２信号肽编码序列置换ＴＮＦ前导肽编码序列，构建出一种在真核细胞中仅产生分泌型ＴＮＦ的重组体；通过缺失二型ＴＮＦ转换的酶解部位而构建出跨膜表达的膜稳定型ＴＮＦ重组体，并建立分别只表达分泌型或膜型及可同时表达两型ＴＮＦ的真核细胞株，比较二型ＴＮＦ的杀瘤效应。结果显示，膜型ＴＮＦ主要经效－靶细胞间直接接触发挥胞毒效应，杀瘤谱比分泌型ＴＮＦ广；ＴＮＦ的分泌型和膜型具有协同效应。通过基因直接注射方式，使膜型及膜稳定型ＴＮＦ重组体稳定表达小于鼠体内，为膜型ＴＮＦ转基因应用奠定了基础。

IL-12和IL-15对外周血CIK细胞增殖和对SMMC-7721肝癌细胞杀瘤效果研究

目的观察常规培养条件下添加白细胞介素(IL)-12、IL-15对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞增殖的影响,观察不同细胞因子组合培养的CIK细胞的杀瘤作用,为高效率、高质量体外制备肿瘤患者自体CIK细胞制剂提供新思路。方法首先筛选出IL-2、IL-12、IL-15最佳添加水平;然后采集健康献血员外周血,分离出单个核细胞后,根据添加的细胞因子种类和组合类型进行分组:A组(IL-2常规培养组)、B组(IL-2^+IL-12组)、C组(IL-2^+IL-15组)、D组(IL-2^+IL-12^+IL-15组)、E组(细胞因子空白对照组);各组单个核细胞分别在培养第0、5、10、15、20天,采用全自动血球计数仪进行CIK细胞计数,锥虫蓝染法检测细胞活性,流式细胞技术检测细胞膜CD3、CD8、CD56阳性率,MTS法测定CIK细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀瘤效果。结果B、C、D组培养第10、15、20天后CIK细胞增殖倍数均明显高于A组(P<0.05);D组培养第10、15、20天CIK细胞增殖倍数均分别明显高于C组(P<0.05)。B、C、D组培养第15、20天CIK细胞膜CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+百分比均分别明显高于A组(P<0.05);D组培养第15、20天CIK细胞膜CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+百分比均分别明显高于B组(P<0.05)。在效靶比5∶1时,各组培养第10、15、20天的CIK细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率均明显高于A组(P<0.05);D、C组培养第10、15、20天CIK细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率分别明显高于B组(P<0.05)。结论 IL-12、IL-15均可促进CIK细胞增殖,IL-15在促进CIK细胞增殖的同时还能增强CIK细胞杀伤肝癌SMMC-7721细胞的活性。

CIK细胞的体外扩增能力及杀瘤效应

目的研究CIK细胞的体外生长扩增能力及杀瘤效应。方法将人外周血用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子(IFN-γ、CD3mAb、IL-1、IL-2),诱导生成CIK细胞,分为CIK-1组和CIK-2组,观察CIK细胞的扩增情况,用流式细胞仪检测其表面标志,MTT法测定其杀瘤活性。结果 CIK细胞中CD3+CD56+细胞经过21d培养后显著增加,百分比达(29.80±8.73)%,与培养前相比差异有统计学意义(P<0.05),CD8+细胞也较培养前显著增加(P<0.05)。CIK细胞具有较强的杀瘤能力,在第7d时CIK-1组杀瘤活性为57.86%,第14d时为71.92%,在第21d时达最高值,为79.06%,与CIK-2组比较杀伤活性显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CIK细胞具有较强的体外扩增能力和杀瘤效应,为肿瘤临床治疗提供了一种新抗肿瘤和主动免疫治疗方法。

胃癌相关抗原与自身CTL细胞增殖及体外杀瘤活性关系

目的 :探讨胃癌相关抗原与胃癌患者自身细胞毒T细胞 (CTL)细胞增殖及体外杀瘤活性的关系。方法 :用生化方法提取胃癌相关抗原 ,体外协同IL 2培养淋巴细胞 ,MTT法测定细胞增殖及杀瘤活性 ,流式细胞仪 (FCM)检测细胞表型变化。结果 :12例胃癌相关抗原阳性患者CTL细胞增殖快于 9例阴性患者 ,统计比较 ,差异有极显著意义 (P <0 0 0 1)。E/T为 80∶1时 ,前者体外杀瘤活性均值也大于后者 (P <0 0 1) ,FCM检测结果表明前者CD+ 8及CD+ 2 5表达率也显著高于后者 (P <0 0 1)。结论 :本研究为解释胃癌等“不敏感群体”现象提供实验依据 ,提示该类抗原诱导的杀伤细胞可望用于胃癌临床免疫治疗 ;结合相关抗原筛查 。

IL－12对肿瘤病人PBMC增殖和杀瘤活性的实验研究

主要观察了ＩＬ－１２与ＩＬ－２联合对健康人和肿瘤病人ＰＢＭＣ增殖和体外杀瘤活性的影响。实验结果表明，单独应用ＩＬ－１０２对肿瘤病人ＰＨＡ活化ＰＢＭＣ增殖活性很小，如与低剂量ＩＬ－２合用，则可明显促进其增殖效应，表明ＩＬ－２可增强ＩＬ－１２的作用。与单用ＩＬ－１２相比，当ＩＬ－１２与低浓度ＩＬ－２合用时，健康人和肿瘤病人ＰＢＭＣ对Ｋ５６２细胞和Ｒａｊｉ细胞的杀伤活性均明显增强，且对Ｋ５６２细胞株杀伤活性明显强于对Ｒａｊｉ细胞株的杀伤活性。上述结果表明，ＩＬ－１２与ＩＬ－２合用对健康人和肿瘤病人ＰＢＭＣ增殖及杀瘤活性影响的格局基本一致。本实验为进一步研究ＩＬ－１２协同其它因子增强肿瘤病人ＬＭ和ＴＩＬ等免疫细胞抗肿瘤效应并进而使ＩＬ－１２过渡到临床肿瘤病人治疗提供了重要的实验依据。

卵巢癌抗原等诱导杀瘤性免疫细胞的实验研究

为了探讨肿瘤过继细胞免疫治疗和研制肿瘤疫苗的新方法，用卵巢癌细胞（ＣＯＣ１）提取可溶性抗原成份，将其与葡萄球菌超抗原共同诱导外周血单个核细胞，置于含ＩＬ２的培养基中培养，待产生杀瘤性免疫效应细胞后，对这种细胞的某些生物学特性进行初步研究，并与ＴＡＫ，ＣＤ３ＡＫ，ＬＡＫ细胞进行比较。结果显示培养到第１０ｄ时，实验组效应细胞，ＴＡＫ细胞，ＣＤ３ＡＫ细胞和ＬＡＫ细胞的增殖活性分别为４０．２倍，４１．７倍，３２．４倍和２１．５倍；对卵巢癌ＣＯＣ１细胞的细胞毒活性分别为８１．２％，８２．５％，５４．３％和５６．７％。实验组效应细胞对４种卵巢癌细胞ＣＯＣ１，ＣＯＣ２，ＳＫＯＶ３和Ａ２７８０的细胞毒活性分别为８３．１％，５１．４％，３７．６％和４９．７％。结果表明，用ＴＳＡ和超抗原共同诱导产生的免疫效应细胞增殖快，细胞毒活性高，对来源于抗原的肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。

ICAM-1协同参与TNFRI介导的TM-TNF-α杀瘤作用

目的 :寻找协同参与TM TNF α杀瘤作用的膜表面分子 ,探讨TM TNF α杀瘤及两型TNF α生物学效应差异的分子机制。方法 :利用抗体封闭实验及RT PCR ,检测ICAM 1及VCAM 1对TNFR1或TNFRII介导的TM TNF α杀瘤效应是否具有协同作用。结果 :封闭表达TNFRI的MCF 7细胞表面的ICAM 1,可显著降低TM TNF α对其杀伤的作用 ;而封闭VCAM 1无明显效应。封闭表达TNFRII的HL 6 0细胞表面的ICAM 1或VCAM 1,均对TM TNF α的杀伤作用无影响。结论 :ICAM 1对于TM TNF

MTT法检测CIK细胞的体外杀瘤活性

目的 观察CIK (cytokineinducedkiller)细胞的体外杀瘤活性。 方法 以LAK (lym phokineactivatedkiller)细胞作对比 ,用MTT法测定并比较CIK细胞与LAK细胞的体外杀瘤活性。 结果 CIK细胞的体外杀瘤活性明显优于LAK细胞 ,杀伤率分别为 2 9%和 15 %。结论 CIK细胞是一种具有较强杀伤活性的免疫效应细胞 。

黄芪多糖脂质体激活巨噬细胞杀瘤细胞形态学观察

应用黄芪多糖＜ＡＰＳ＞和ＡＰＳ脂质体对肝癌患者腹水中的巨噬细胞＜Ｍ＞进行体外激活，以人肝癌细胞株为靶细胞，光镜下观察凋谢细胞数目。ＡＰＳ１００μｇ／ｍｌ时凋谢细胞１５．７４±１．０４％，ＡＰＳ脂质体１μｇ／ｍｌ时为５０．１３±２．１７％。电镜下见经激活处理的Ｍ能使靶细胞核破碎，呈现大量凋谢小体。未经激活处理的Ｍ不能引起靶细胞这些改变。结果表明，ＡＰＳ和ＡＰＳ脂质体可有效地激活Ｍ，后者通过凋谢方式使肿瘤细胞死亡。

接种密度对C57BL/6小鼠CIK细胞增殖、分化及杀瘤作用的影响

目的:探讨不同接种密度对C57BL/6小鼠细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖分化及杀瘤作用的影响,进一步优化CIK细胞培养方法。方法:按照1×10~6/mL(A组)、4×10~6/mL(B组)、8×10~6/mL(C组)、12×10~6/mL(D组)4种接种密度培养细胞,加入必要的细胞因子,14 d后收获细胞,通过流式细胞术、CCK-8法对细胞增殖、分化、杀瘤作用进行分析。结果:培养过程中,C组细胞形态及增殖能力优于A、B组,在14 d时收获细胞并对其进行检测时发现,C组CD3^+/NK1.1^+细胞所占比例明显高于A、B组,杀瘤活性也优于A、B组;D组细胞密度过大,在7 d细胞进入快速增殖期后出现大面积死亡。结论:适当提高C57BL/6小鼠CIK细胞的接种密度利于细胞增殖、分化及杀瘤作用的形成,选择8×10~6/mL的接种密度是较为合适的。

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting,MACS)分离纯化正常人外周血CD+3T细胞,体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响;MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力;利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用,且存在时间依赖性,在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68.38%,显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18.31%);而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61.02%和14.79%,有显著的抗原特异性(P=0.0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。

肿瘤疫苗利播停(Lipostn)对人胃腺癌LAK增殖及杀瘤活性的影响

利播停(Lipostn)为解放军301医院袁玫等提取纯化的一种癌细胞表面抗原,属糖蛋白类物质,分子量为430KD,可为单克隆抗体CL-3识别。同时,利用CL-3单抗结合免疫电泳方法可检测粪便中胃肠道肿瘤相关抗原。可认为利播停与患者体内肿瘤抗原成份有一定免疫交叉性反应。 已证实Lipostn可诱导鼠淋巴细胞(取自肿瘤引流区淋巴结)对含特定抗原的肿瘤细胞有杀伤作用。基此,我们研究Lipostn对人胃腺癌LAK增殖及杀瘤活性(体外)的影响。实验发现,单独的Lipostn不能诱导患者外周血PBMC增殖,但与rIL-2(400μ/ml)之间存在协同促增殖作用,以2.5μg/ml剂量最为显著。选用人胃低分子化腺癌NMK细胞为靶细胞,以MTT试验测定其对人胃腺癌LAK杀瘤活性的影响。观察到,该剂量Lipostn与rIL-2(400U/ml)协同诱导的胃腺癌LAK杀瘤活性得到了显著增强,表现在维持同一水平的杀瘤活性下,Lipostn可以减少效应细胞的数量。

α-CD3单抗对肿瘤特异性T细胞的扩增及其杀瘤活性的影响

用α-CD3单抗激活FBL-3红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞获取肿瘤特异性T细胞，并观察α-CD3单抗对肿瘤特异性T细胞的增殖、杀瘤话性及表型变化的影响。研究采用四种不同的培养方案。(1)单独使用α-CD3单抗(CD3组)；(2)单独使用20U／ml rIL-2(IL-2组)；(3)使用α-CD3单抗48小时后仅加入20U/ml rIL-2(CD3^-IL-2组)

超抗原SEB诱导人CTL细胞杀瘤条件优化

目的通过正交设计优化CTL细胞最佳杀瘤条件。方法补体裂解法分离CTL细胞,MTT法测定CTL细胞杀瘤活性,正交设计选择CTL细胞最佳杀瘤条件。结果在SEB浓度为10-6g/ml,SEB作用CTL细胞时间为24h,CTL细胞与肿瘤细胞之比为20∶1情况下CTL细胞杀瘤活性最强。结论CTL细胞最佳杀瘤条件组合为SEB10-6g/ml,作用时间24h,效靶比20∶1。

IL-2基因转染的人卵巢癌细胞对人外周血淋巴细胞杀瘤功能的影响

目的 :研究白介素 - 2 (interleukin- 2 ,IL - 2 )基因转染的人卵巢癌细胞对人外周血淋巴细胞 (peripheral bloodiymphocytes,PBL)杀瘤活性的影响。方法 :采用脂质体携带 IL- 2基因转染人卵巢癌细胞系 3AO细胞 ,与正常人 PBL 混合培养 ,利用 MTT法测定混合培养后 PBL对已转染 IL- 2基因的 3AO细胞抑制率。结果 :基因转染后 3AO细胞生长良好 ,光镜形态下未观察到凋亡改变 ;转染后的 3AO细胞转录并产生 IL - 2 m RNA;PBL对转基因 3AO细胞的抑制率明显高于无基因转染的 3AO细胞的抑制率 (P<0 .0 1)。结论 :IL- 2基因修饰的卵巢癌细胞能够改变淋巴细胞的功能而发挥其抗肿瘤作用。

脐血及外周血中细胞毒性T细胞的体外诱导及杀瘤活性研究

目的 在体外研究卵巢癌细胞诱导脐血来源的CTL的扩增及其杀瘤活性。探索其用于卵巢癌过继免疫治疗的可行性。方法 从脐血中分离出单个核细胞 ,用不同剂量的SKOV 3细胞及IL -2刺激扩增 ;用FCM检测表型变化 ,MTT比色法检测其对SKOV 3及K 5 62的杀伤活性 ,并与用同样方法所得外周血来源CTL细胞相对照。结果 用 2× 10 6个 /ml的卵巢癌细胞可诱导脐血CTL细胞较高的杀伤活性为 5 3 .46%± 8.45 % ;诱导 10天后杀伤SKOV 3活性为 44 .0 9%± 6.95 % ,杀伤K 5 62的活性为41.0 3 %± 5 .79% ,CD3、CD4、CD 8及CD4/CD8值分别为 5 2 .0 0± 9.5 0、3 6.0 0± 4.80、3 8.0 0± 10 .2 0、1.10± 0 .40。结论 应用适当剂量的抗原可诱导较高活性的脐血源CTL 。

植物血凝素对杀瘤细胞刺激作用的研究

本文应用植物血凝素（ＰＨＡ）对ＬＡＫ细胞和ＣＤ３ＡＫ细胞进行预刺激，并分析几种效应细胞在增殖水平、细胞表型、对Ｋ５６２细胞等的杀伤作用，结果经ＰＨＡ预刺激后的效应细胞体外扩增能力强，ＣＤ８表达水平高，对Ｋ５６２和Ｒａｊｉ有较强的抑制能力。

干扰素对LAK细胞产生和杀瘤作用的影响

淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine-Activated Killer Cell,LAK)主要来自T淋巴细胞和自然杀伤细胞(Natural Killer Cell,NK),可从外周血、脾脏及骨髓等多种组织中诱生,具有广谱的MHC(主要组织相容性抗原)非限制性地体外杀瘤活性和良好的体内抗瘤作用,因而日益倍受人们重视。近年来的研究还发现,LAK细胞的诱生与杀瘤作用受多种因素的影响,其中免疫调节剂干扰素(Interferon,IFN)的调节作用更为引人注目。其调节方式。