Panton-Valentine杀白细胞素原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的原核表达金黄色葡萄球菌Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)蛋白,并进行生物学活性鉴定。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌DNA,利用PCR扩增LukF-PV和LukS-PV编码基因,亚克隆入表达载体pET28 a,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21株,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后获得可溶性的蛋白,Western blot对其鉴定。并以人多形核粒细胞(PMNs)为靶细胞检测其生物学活性。结果成功构建了LukF-PV和LukS-PV基因的表达载体,经IPTG诱导和亲和层析纯化法获得重组蛋白,Western blot鉴定证实其为重组PVL蛋白。实验表明该蛋白具有诱导人多形核粒细胞(PMNs)凋亡的作用。结论成功地表达获得了具有生物学活性的PVL重组蛋白,为PVL快速检测方法的建立和致病机制研究奠定基础。

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a(+)表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a(+)重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。

国内杀白细胞素阳性金黄色葡萄球菌感染的研究现状

金黄色葡萄球菌是临床引起感染性疾病最常见的病原菌之一，它的致病性与其携带的多种毒素因子有关。携带毒素因子的金黄色葡萄球菌毒力更强，与感染后疾病的严重程度呈正相关，产毒素菌株所造成的感染重、病程长，加大治疗难度和护理难度，同时增加了患者的痛苦和经济负担。杀白细胞素（PVL）是金黄色葡萄球菌产生的一种重要外毒素，

杀白细胞素基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性分析

目的了解杀白细胞素(PVL)基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药情况,指导临床合理用药。方法对临床收集的47株PVL基因阳性MRSA采用PCR法检测PVL基因,采用纸片扩散法进行药敏试验,并对结果进行分析。结果 47株MRSA的PVL基因检出率为46.8%,PVL基因阳性、阴性MRSA对β-内酰胺类抗菌剂均100.0%耐药,PVL基因阳性MRSA对氨基糖苷类、利福平、四环素、红霉素、环丙沙星、亚胺硫霉素等抗菌剂全部耐药,对盐酸克林霉素的耐药率为95.5%;PVL基因阴性MRSA对上述抗菌剂的耐药性虽比PVL基因阳性MRSA轻,但耐药率也在88.0%以上,2组间耐药性比较,差异有统计学意义(P<0.05)。对复方新诺明敏感率在90.0%以上,未发现对万古霉素耐药株。结论 PVL基因阳性MRSA在临床检出率已较高,耐药性严重并呈多重耐药特征,增加了临床抗感染治疗的难度。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素的研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）普遍存在,是导致医院和社区感染的重要病原菌。MRSA最早出现在医院内呼吸道感染中,随着时间的推移,逐渐向院外扩散,社区相关性MRSA（communityassociated MRSA,CA-MRSA）成为院外感染的重要病原菌。有研究者发现,几乎所有CA-MRSA存在杀白细胞素（pantonvalentine leucocidin,PVL）[1-4]。

产杀白细胞素金黄色葡萄球菌感染的研究现状

国外多数回顾性研究发现产杀白细胞素(PVL)金黄色葡萄球菌感染有着特有的临床表现,特别是产PVL金黄色葡萄球菌相关性坏死性肺炎可能为一新现的临床疾病,由此PVL在金黄色葡萄球菌感染中的致病研究日益受到重视。本文就目前对产PVL金黄色葡萄球菌感染的致病机制、流行病学、检测和防治等问题研究作一综述。

携带Panton-Valentine杀白细胞素基因金黄色葡萄球菌所致感染类型研究

目的研究携带 Panton-Valentine 杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)基因金黄色葡萄球菌所致感染类型。方法利用多重 PCR 检测金黄色葡萄球菌临床分离株的 PVL 基因,应用多位点基因序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对 PVL 基因阳性的菌株进行序列分型,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的 SCCmec 基因分型采用多重 PCR。结果 26株携带 PVL 基因的金黄色葡萄球菌有13株为 ST88,5株为 ST239,5株为 ST398,ST25、ST30和 ST59各1株。20株为医院获得株,主要引起肺部感染和术后伤口化脓性感染;6株为社区感染株,主要引起软组织化脓性感染。7株 MSSA全部为 ST88,主要引起化脓性感染。而19株 MRSA分布在6种 ST 型中,主要有 ST88-SCCmecⅢA、ST239-SCCmecⅢ、ST398-SCCmecⅣ和ST398-SCCmecⅢ。26株菌株分布于14个病区,在产科发生过携带 PVL 基因的 ST88-SCCmecⅢA-MRSA 克隆株的播散。结论本院分离的携带 PVL 基因的金黄色葡萄球菌的序列型主要为 ST88、ST239 和 ST398,既可造成医院感染也可造成社区感染且可能引起克隆株的播散。

烧伤创面携带Panton-Valentine杀白细胞素基因金黄色葡萄球菌的流行情况及基因分型

目的调查临床分离自烧伤创面携带Panton—Valentine杀白细胞素（PVL）基因金黄色葡萄球菌的流行状况及基因分型。方法收集2008年1月-2012年10月笔者单位从676例烧伤门诊及住院患者的创面分泌物标本中分离的金黄色葡萄球菌163株，按患者年龄分为4组：儿童组（小于15岁）共63株，青年组（大于或等于15岁且小于31岁）共45株，中年组（大于或等于31岁且小于61岁）共44株，老年组（大于或等于61岁）共11株。经鉴定后确定其感染类型。采用头孢西丁纸片法筛选甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA），采用全自动微生物分析仪检测金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素、苯唑西林等11种临床常用抗菌药物的耐药性。PCR检测金黄色葡萄球菌PVL毒力基因，多重PCR对PVL阳性MRSA菌株进行葡萄球菌染色体mee（SCCmec）分型，PCR对PVL阳性MRSA菌株行多位点序列分型（MLST）。采用WHONET5．4软件分析菌株相关数据，并采用SPSS13．0统计软件对两两比较行χ2检验。结果163株金黄色葡萄球菌中，医院获得性感染菌株89株，社区获得性感染菌株74株；PVL阳性35株，阳性率21．5％（35／163）；38株为MRSA；MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）中PVL携带率分别为36．8％（14／38）和16．8％（21／125），与MSSA相比，MRSA的PVL携带率更高（χ2=6．942，P〈0．05）。各年龄组金黄色葡萄球菌PVL携带率比较，差异无统计学意义（χ2值为0～0．067，P值均大于0．05）。药物敏感试验结果显示，163株金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素、克林霉素的耐药率较高，分别为95．1％（155／163）、65．6％（107／163）、33．1％（54／163），对大部分抗菌药物耐药性均较低（〈26．0％），未检测到利奈唑胺和万古霉素耐药菌株。PVL阳性金黄色葡萄球菌与PVL阴性金黄色葡萄球菌相比，除苯唑西林外（P〈0．01），2者对其他抗菌药物耐药性差异均无统计学意义（P值均大于0．05）。14株PVL阳性MRSA中，SCCmeeⅢA型8株，SCCmeeⅡ型3株，SCCmecⅣ型1株，未分型2株，未检测到SCCmecI型MRSA。14株PVL阳性MRSA菌株MLST分型结果显示，共有3种序列分型（sT），包括11株ST239、2株ST5和1株ST59。结论PVL阳性MRSA菌株在烧伤创面感染中有一定程度的流行，其遗传学特征以ST239-SCCmecmA为主；PVL阳性MRSA较易暴发流行，应加强对该类菌株的监测。

不同来源金黄色葡萄球菌Panton—Valentine杀白细胞素基因的表达及其与agrA表达相关性研究

目的研究不同标本分离的金黄色葡萄球菌临床分离株Panton-Valentine杀白细胞素（PVL）的表达及与agrA表达的相关性。方法收集2003年1月至2010年12月4家医院从临床各种标本中分离的金黄色葡萄球菌，所有菌株均为非重复株。采用普通PCR和DNA测序检测PVL基因。采用实时荧光定量PCR检测lukSmRNA和agrAmRNA的量。结果经过PCR扩增及测序共筛检出96株PVL阳性的金黄色葡萄球菌，其中58株为医院获得株，28株为社区获得株，10株由于临床资料不全不能区分；54株分离白血液标本，33株分离自脓液标本及9株分离白痰液标本；67株分离自成人的临床标本，29株分离自儿童的临床标本。分离自脓液标本和血液标本的菌株lukSmRNA的相对表达量的中位数分别为1．500和0．818，分离自脓液标本菌株的lukSmRNA的表达量明显高于分离白血液标本菌株的量（U=634，P=0．025）；分离自儿童和成人的菌株lukSmRNA的相对表达量的中位数分别为1．292和0．540，儿童分离株的lukSmRNA的表达量明显高于成人分离株的量（U=660，P=0．013）；社区分离株和医院分离株lukSmRNA的相对表达量的中位数分别为1．034和0．536，社区获得株的lukSmRNA的表达量明显高于医院获得株的量（U：338，P=0．012）。在总的分离株中，lukSmRNA与agrAmRNA的表达量存在正相关性（r=0．592，P〈0.01）；分离自脓液标本菌株的lukSmRNA与agrAmRNA相关系数较高（r=0．810，P〈0．01），但分离自血液标本菌株的两者相关性系数较低（r=0．543，P〈0．叭）。分离自儿童标本菌株的lukSmRNA与agrAmRNA量之间相关性更高，为0．804（P〈0．01），而分离自成人标本菌株的两者相关系数为0．476（P〈0．01）。社区获得株与医院获得株两者的相关系数分别为0．767（P〈0．01）和0．556（P〈0．01）。结论不同的感染类型luks／F—PV基因的表达不同，agr系统可能对lukS／F—PV基因的表达具有正调节作用，尤其是在脓液和儿童分离株中发挥重要调节作用。（中华检验医学杂志，2013，36：313-317）

荆州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子型别及相关临床特征

目的：了解湖北省荆州地区流行的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ MRSA）的主要分子型别和相关临床特征。方法连续收集2014年1至12月分离自湖北省荆州市中心医院住院患者并经mecA基因检测确证为MRSA的80株临床分离株。采用全自动微生物检测仪Vitek 2 Compact对所有菌株进行药敏试验，采用多重聚合酶链反应（ PCR）和基因测序分别检测菌株的葡萄球菌A蛋白（ SPA）和葡萄球菌染色体mec基因盒（ SCCmec）分子型别，并采用PCR法检测所有菌株的杀白细胞素（ PVL）基因。采用χ2和Wilcoxon秩和检验对数据进行处理。结果80株MRSA中共检出16种spa基因型别，以t030和t437为主，分别为40株（50％）和23株（28．8％）；共检测到SCCmecⅠ～Ⅴ型77株，以SCCmecⅢ和SCCmecⅣ型检出最多，分别为36株（45．0％）和28株（35．0％），且SCCmecⅢ型对应的spa型以t030（33／36，91．7％）为主，SCCmecⅣ型对应的spa型别以t437（20／28，71．4％）为主。t030型／SCCmecⅢ型MRSA感染患者年龄大于t437／SCCmecⅣ感染的患者（ T＝446．500和607．500， P＜0.01）；前者多来自外科和重症监护病房（ ICU），后者多来自儿科，两种型别感染者的病区分布差异有统计学意义（χ2＝33．724和29．768，P＜0．01）；t030／SCCmecⅢ型MRSA对利福平、红霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星、莫西沙星、环丙沙星和庆大霉素的耐药性均＞70％；t437／SCCmecⅣ型MRSA除对红霉素、克林霉素和四环素耐药外，对多种非β-内酰胺类抗菌药物均敏感，耐药率基本＜20％。另外，检出携带pvl毒力基因的MRSA 11株（13．8％），以t437-SCCmecⅣ型为主（7株）。结论荆州地区流行的MRSA分子型别众多，但以t030-SCCmecⅢ型和t437-SCCmecⅣ型为主。 t030-SCCmecⅢ型菌株表现出多重耐药的特点，感染对象多为外科和ICU病区的老年患者；t437-SCCmecⅣ型菌株对多种非β-内酰胺类抗菌药物敏感，感染对象主要为儿童和青少年。

衢州地区皮肤软组织感染社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子特征及毒力基因分布

目的:了解皮肤软组织感染(SSTIs)社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)的分子特征、耐药率及毒力基因携带情况,为临床抗生素使用及感染防控提供流行病学依据。方法:回顾分析衢州市人民医院2014至2018年皮肤软组织感染金黄色葡萄球菌,从中筛选出CA-MRSA菌株共72株,采用多位点序列分型(MLST)方法进行分子分型,采用纸片扩散法(K-B法)和微量肉汤稀释法进行药敏试验,使用聚合酶链式反应(PCR)方法对所收集菌株的7种毒力基因包括纤连蛋白结合蛋白基因(fnbA,fnbB)、溶血素基因(hla,hlb)、肠毒素基因(sec,seh)、杀白细胞素基因(PVL)进行分析,采用χ^2检验或Fisher精确检验对ST59组和非ST59组之间耐药率和毒力基因携带率之间的差异进行统计分析。结果:衢州地区SSTIs CA-MRSA以ST59型(55.56%,40/72)为主要流行克隆株。所有分离株对红霉素(90.28%,65/72)、克林霉素(68.06%,49/72)、四环素(41.67%,30/72)具有较高的耐药率,对万古霉素、呋喃妥因、达托霉素及利奈唑胺全部敏感,序列型59(ST59)型对克林霉素的耐药率为(85.00%,34/40),ST59对克林霉素的耐药率明显高于其他克隆型(χ^2=11.886,P<0.01)。其余抗生素的耐药率在两组之间没有显著性差异。72株皮肤软组织感染CA-MRSA毒力基因的携带率分别为hla(97.22%,70/72)、hlb(33.33%,24/72)、fnbA(50.00%,36/72)、fnbB(48.61%,35/72)、PVL(63.89%,46/72)、sec(4.17%,3/72)、seh(4.17%,3/72),PVL基因在ST59中的携带率为(77.50%,31/40),ST59 PVL携带率显著高于在其他非ST59中的携带率(χ^2=7.227,P<0.01)。结论:衢州地区SSTIs CA-MRSA的主要克隆为ST59型,与全国其他地区一致,ST59型分离株PVL基因的携带率明显高于其他分离株。SSTIs CA-MRSA对红霉素及克林霉素具有较高的耐药率,治疗中不宜作为经验性用药的首选。