5-碘代杀结核菌素对HT-29细胞DLC-1基因的去甲基化作用

目的探讨5-碘代杀结核菌素(5-iodotubercidin,ITU)对人结肠癌细胞HT-29株增殖凋亡及DLC-1基因表达的影响。方法不同浓度(0.1、0.5、1、2、4、6、8、10μmol/L)ITU作用于HT-29细胞48 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测HT-29细胞的增殖活性;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48 h,流式细胞仪检测其凋亡率;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48 h,亚硫酸氢盐克隆测序法(BSP)检测DLC-1基因启动子区Cp G岛甲基化情况;同上的处理细胞的方法,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)mRNA的表达;Western blot检测DLC-1基因蛋白表达。结果 1ITU可明显抑制HT-29细胞活力,在一定范围内随着药物浓度增加抑制细胞活力的作用越强(P<0.05),以6μmol/L组对HT-29细胞影响最大,IC50=(5.92±0.62)μmol/L。2分别以0、2、4、6μmol/L ITU作用于HT-29细胞后,流式细胞仪检测各组凋亡率,分别为(9.56±2.21)%、(22.18±3.16)%、(34.23±3.16)%、(40.50±3.16)%,表明随着ITU浓度增加,对HT-29细胞的促凋亡作用越强。3经0、2、4、6μmol/L ITU处理后DLC-1基因启动子区Cp G岛甲基化率分别为91.67%、75.00%、61.67%、43.33%,表明ITU可以引起DLC-1基因启动子区甲基化程度降低。4在HT-29细胞中可检测到少量DLC-1 mRNA和蛋白的表达;相同条件经0、2、4、6μmol/L ITU处理细胞后检测显示DLC-1基因mRNA和蛋白的表达增加,并随浓度增长,mRNA及蛋白表达随之增加。结论 ITU可抑制人结肠癌HT-29细胞增殖,促进HT-29细胞凋亡,而这种抑制增殖作用可能和ITU降低DLC-1基因启动子区甲基化水平而诱导DLC-1基因上调有关。

5-碘代杀结核菌素对小鼠神经管的影响及其作用机制

目的探讨腺苷激酶(adenosine kinase,ADK)抑制剂5-碘代杀结核菌素(5-iodotubercidin,ITU)对小鼠神经管的影响及其作用机制。方法将妊娠7.5 d的C57BL/6J小鼠随机分为ITU组(经腹腔分别注射2、3、4、5、6、7 mg/kg的ITU)和对照组(经腹腔注射含2%DMSO的生理盐水),妊娠11.5 d时,取胚胎,观察其发育情况。取对照组及神经管缺陷(neural tube defect,NTD)组(最佳剂量ITU)胚胎进行HE染色,观察小鼠神经管发育情况;ELISA法检测NTD组孕鼠血清中腺苷、AMP、S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)水平;N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化检测试剂盒检测两组小鼠胚胎脑组织中m6A含量;EdU及TUNEL法分别检测两组小鼠胚胎脑组织中上皮细胞增殖及凋亡情况;Western blot法检测m6A相关酶蛋白(METTL3、FTO、YTHDF2)、细胞增殖相关蛋白(PCNA)及细胞凋亡相关蛋白(caspase-3)的相对表达水平。结果对照组胚胎生长发育良好,未出现NTD;ITU组随着剂量的增加,NTD的发生率逐渐增加,剂量为5 mg/kg时,小鼠NTD的发生率最高(32.2%),确定该剂量为建立NTD模型的最佳ITU剂量。对照组胚胎神经管发育良好,管腔规则,神经管闭合完全;NTD组胚胎神经管管壁厚薄不一,管腔不规则,神经管未完全闭合。NTD组孕鼠血清中腺苷、SAM、SAH的含量于注射后8 h显著增加(P<0.01),AMP含量显著下降(P<0.05)。与对照组比较,NTD组小鼠胚胎脑组织m6A含量降低,METTL3的相对表达量明显减少(P<0.05),FTO、YTHDF2的相对表达量无明显变化(P>0.05);PCNA的相对表达量明显减少(P<0.05),caspase-3的相对表达量明显增加(P<0.05),表明小鼠胚胎脑组织中上皮细胞增殖减弱,细胞凋亡增加。结论ITU可诱导小鼠NTD的发生,其作用机制可能与m6A含量降低导致神经上皮细胞增殖和凋亡紊乱相关。

5碘代杀结核菌素的抗真菌及作用机制研究

侵袭性真菌感染的高发生率和死亡率使其成为临床的一大棘手难题。真菌耐药性的出现进一步增加其治疗难度。因此,开发新型抗真菌药物是解决该难题的策略之一。蛋白激酶类抑制剂在肿瘤、糖尿病和风湿病等领域被广泛研究,但在抗真菌领域研究较少。本研究经前期筛选100个结构多样的蛋白激酶类小分子抑制剂的抗真菌活性,发现12个化合物表现不同程度的抗真菌活性,其中5碘代杀结核菌素(5-Itu)的抗真菌活性较优(最小抑菌浓度范围为2~4μg·mL^(-1))。同时,体外活性评价实验发现该化合物还具有良好的杀菌、抗生物被膜和抑制菌丝形成的活性。作用机制研究显示, 5-Itu可改变细胞膜甾醇成分和超微结构,增加细胞膜通透性,诱导细胞凋亡。因此对其进一步研究,有望发现新型的抗真菌先导化合物。

阿舒假囊酵母过量合成核黄素性能的改良

以６０Ｃｏ的ｒ射线为诱变剂，核黄素合成途径的中间产物的结构类似物为“筛子”，筛选了阿舒假囊酵母（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍａｓｈｂｙｉ）的四种抗性突变株：杀结核菌素抗性突变株（Ｔｕｂｒ）、２－脱氧葡萄糖抗性突变株（２－ＤＧｒ）、８－氮杂鸟嘌呤（８－ＡＧｒ）和抗残液突变株。杀结核菌素抗性突变株Ｔ３０的摇瓶核黄素产量由出发菌的２．５～２．８ｍｇ／Ｌ提高并稳定在３．５ｍｇ／Ｌ以上，经初步优化（培养基配方）后，稳定在５．４ｇ／Ｌ以上。