杀菌/渗透性增强蛋白功能及应用前景

杀菌/通透性增强蛋白(BPI)是存在于中性粒细胞中的阳离子蛋白,约为55 kD.BPI能与革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖结合,增加外膜对抗菌药的通透性,具有特异性杀灭革兰氏阴性菌及结合/中和内毒素的生物学功能,在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景.近年来,国内外对BPI研究颇多,并逐渐发现BPI还具有调理作用、抗真菌、抗原虫和抑制血管生成等许多功能,被学者称为未来的"超级抗生素".本文主要就BPI的结构、分布、生理功能、作用机理及临床研究方面的研究进展作一综述.

杀菌/渗透增强蛋白功能区抗菌肽与内毒素亲和性的SPR技术检测

目的:研究杀菌/渗透增强蛋白(BPI)不同功能区抗菌肽与内毒素(LPS)结合的能力。方法:设计、合成来自杀菌/渗透增强蛋白N端不同功能区的3段抗菌肽,分别为BPI22-36、BPI85-99和BPI147-161,将其固定于CM5蛋白质芯片上,使用表面等离子共振(SPR)仪检测3种抗菌肽与LPS和类脂A(Lipid A)相互作用的情况。结果:3种抗菌肽中,BPI147-161与LPS和Lipid A结合的能力最强,BPI85-99次之,但BPI22-36与其不结合;BPI147-161与Lipid A的亲和常数KA为1.12×106L/mol,相比,多黏菌素B(PMB)的亲和常数KA为5.58×106L/mol。结论:来自杀菌/渗透增强蛋白的抗菌肽BPI147-161能有效地中和内毒素,这可能为败血症休克的治疗提供一种新的策略。

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的探讨在毕赤酵母中进行杀菌/渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPI588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上,使其准确融合于α交配因子分泌信号之后,电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后,分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coliJM109的抑菌实验。结果BPI588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中,并有转录产物mRNA的存在,表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌/渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。

猪杀菌性/通透性增强蛋白(BPI)的功能及其在抗病育种中应用的研究进展

杀菌性/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)有较强的杀菌作用(主要为革兰氏阴性菌)和中和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的活性,以及增强单核细胞和嗜中性粒细胞对病原菌的吞噬功能。近年来,BPI的生物学功能受到广泛关注,被称为机体内的"超级抗生素",BPI基因被很多学者作为抗病候选基因进行探索。作者综述了猪BPI基因的结构、生物学功能及其与猪抗性的关系等,阐述了BPI基因在猪抗病育种中的研究进展及应用前景,为下一步猪BPI基因的功能研究及其在抗病育种实践中的应用提供理论依据。

杀菌性通透性增强蛋白对大肠杆菌脓毒症小鼠的保护作用

本文观察了BPI对大肠杆菌脓毒症小鼠预后的影响及其可能机制。研究结果显示,BPI治疗组动物72小时存活率明显高于生理盐水对照组(P<0.01);注菌后0.5、1h,BPI组血清内毒素水平明显低于生理盐水(NS)对照组(P<0.01);注菌后1.5h,BPI组血清TNF_α峰值也明显低于NS对照组(P<0.01);但两组间血液细菌计数在注菌后 0.5、1.5和3h均无明显差异。结果提示,BPI对大肠杆菌脓毒症具有明显的防治作用,这可能与其拮抗细菌内毒素,抑制TNF_α产生有关。

杀菌性通透性增强蛋白对失血性休克的保护作用及其机理

分别在失血和复苏开始即刻ｉｖ杀菌性／通透性增强蛋白（ＢＰＩ）１．５和３．５ｍｇｋｇ－１，观察ＢＰＩ对大鼠失血性休克转归的影响．结果显示，ＢＰＩ治疗能明显改善失血性休克大鼠肝肾功能，提高休克动物存活率（ＢＰＩ组８１％ｖｓ休克对照组４４％，Ｐ＜０．０５），ＢＰＩ组大鼠复苏后与休克前的血浆内毒素（０．２０±０．０４ｖｓ０．２４±０．０５ｋＵＬ－１）水平无明显变化，血浆肿瘤坏死因子α和白介素６水平较休克前明显升高，但均显著低于休克对照组．提示ＢＰＩ对失血性休克大鼠具有一定的保护作用，其机理可能与ＢＰＩ拮抗休克时内源性内毒素活性，抑制细胞因子反应有关．

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的 克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法 提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果 获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论 我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究

杀菌-通透性增强蛋白对分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜TNF-α和IL-6表达的影响

目的 :探讨杀菌 -通透性增强蛋白 (BPI)对分泌性中耳炎 (OME)大鼠中耳黏膜 TNF- α和 IL- 6 m RNA及蛋白表达的影响和意义。方法 :采用大鼠中耳腔注射脂多糖 (L ipopolysaccharide,L PS)制备 OME模型 ,动物分为 L PS实验组和 BPI治疗组。利用 EL ISA和 RT- PCR方法检测中耳黏膜组织 TNF- α和 IL- 6 m RNA及其蛋白的表达。结果 :L PS实验组和 BPI治疗组在第 1、 2天均有 IL- 6的表达 ,但 L PS组表达量高于 BPI组 (P<0 .0 5 )。在第 7天后两组均无表达 ;而 TNF- α的表达贯穿于两组实验的始终 ,但 L PS组表达量高于 BPI组 (P<0 .0 5 )。结论 :IL- 6和 TNF- α在中耳炎病变的形成中起作用 ;BPI通过抑制细胞因子表达和分泌 ,减轻炎症刺激 ;BPI是一个潜在的治疗 OME的有效药物 ,可能预防慢性

杀菌-通透性增强蛋白对分泌性中耳炎大鼠水通道蛋白和黏蛋白表达的影响

目的观察杀菌-通透性增强蛋白对分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中水通道蛋白和黏蛋白表达的影响,探讨可能的作用机制。方法采用内毒素制备分泌性中耳炎大鼠模型,将70只大鼠随机分为模型组(10只)和杀菌-通透性增强蛋白(bactericidal-permeability increasing protein,BPI)组(60只),另取10只大鼠作为正常对照组,采用ELISA法检测给药后各组大鼠中耳积液中水通道蛋白AQP1、AQP4及黏蛋白MUC5B、MUC5AC水平,实时荧光定量PCR法检测各组大鼠中耳黏膜中AQP1、AQP4及MUC5B、MUC5AC mRNA的表达水平。结果模型组AQP1蛋白及mRNA表达量显著低于正常对照组,而AQP4、MUC5B、MUC5AC蛋白及mRNA表达量显著高于正常对照组(P<0.01)。经BPI治疗后,AQP1的表达升高,而AQP4、MUC5B、MUC5AC的表达降低(P<0.05或0.01)。结论 AQP1、AQP4及MUC5B、MUC5AC在分泌性中耳炎病变的形成中起一定作用;BPI通过提高AQP1,抑制AQP4及MUC5B、MUC5AC的表达和分泌,从而减轻分泌性中耳炎的积液分泌;BPI是一个潜在的治疗分泌性中耳炎的药物,可能有效预防慢性分泌性中耳炎的发生。

人杀菌通透性增强蛋白功能性N端片段在酵母细胞表面的展示和鉴定

目的:建立BPI23酵母细胞表面展示方法,使之表达具有生物活性的BPI23蛋白。方法:构建pYD1-BPI600重组质粒,转化酵母细胞,经半乳糖诱导使BPI23在酵母细胞表面表达;采用间接免疫荧光法,用荧光显微镜和流式细胞仪检测BPI23在酵母细胞表面的展示情况;采用鲎基质显色法,检测BPI23中和内毒素的生物学活性。结果:酶切和DNA测序鉴定证实,pYD1-BPI600重组质粒含有人BPI600基因片段。荧光显微镜和流式细胞仪检测结果显示,BPI23在pYD1-BPI600重组质粒转化的酵母细胞表面得到展示;在诱导后第24小时展示BPI23的酵母细胞数占总细胞数的39%。酵母细胞表面展示的BPI23具有中和内毒素的活性。结论:成功构建了pYD1-BPI600酵母表达载体,转化后在酵母细胞表面展示了功能性目的蛋白,为BPI23突变体库的建立和功能优化BPI23突变体的筛选奠定了基础。

重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的研究

目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、脂多糖结合蛋白(LBP)、肿瘤坏死因子α(TNFα)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBPI21剂量为0.625 mg/kg)大鼠,6、12 h血浆LPS含量明显低于内毒素组大鼠相同时间点LPS含量(P<0.01),血清LBP、TNFα含量各检测时间点均明显低于内毒素组大鼠相同时间点的含量(P<0.01);与内毒素组大鼠相比,rBPI21治疗2、3、4组(rBPI21剂量分别为1.25、2.5、5.0 mg/kg)大鼠各检测时间点血浆LPS,血清LBP、TNFα含量均明显降低,大鼠24 h生存率由内毒素组的16.7%分别上升到58.3%、91.7%、100.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论rBPI21对内毒素血症大鼠的保护作用机制主要是通过促进体内LPS的聚合和清除,降低LPS活性,从而抑制LBP的生成,减少TNFα等细胞因子的过度表达。

杀菌/通透性增强蛋白对分泌性中耳炎模型大鼠损伤黏膜的修复作用

目的:探讨杀菌/通透性增强蛋白(BPI)对分泌性中耳炎(OME)损伤黏膜的修复作用,阐明OME的发病机理。方法:Wistar大鼠(40耳)随机分为正常对照组(4耳)、BPI对照组(4耳)、咽鼓管阻塞(ETO)组(8耳)、内毒素(LPS)注射组(8耳)、ETO+LPS组(8耳)及ETO+LPS+BPI组(8耳),通过咽鼓管阻塞和中耳腔注射LPS制备OME动物模型,在动物模型制备后第1、2和4周分别处死动物,光镜和扫描电镜观察中耳黏膜的变化。结果:正常对照组、BPI对照组大鼠的中耳黏膜保持正常形态,在咽鼓管的鼓室口处可见较多的假复层立方或柱状上皮细胞,这些上皮细胞含有较多的纤毛细胞和少量杯状细胞,构成大鼠中耳粘液纤毛输送系统;上鼓室处的黏膜由单层、扁平鳞状上皮细胞和少量微绒毛构成,细胞界限清楚,呈多边形,纤毛细胞数量较咽鼓管鼓室口处明显减少。LPS注射组、ETO组、ETO+LPS组大鼠中耳黏膜明显增厚,在咽鼓管鼓室口可见纤毛细胞减少、杯状细胞增多,同时在上鼓室上皮层观察到数量较多的假复层立方上皮细胞。而ETO+LPS+BPI组大鼠为近似正常的中耳黏膜,上鼓室处的黏膜为单层鳞状上皮细胞和少量微绒毛。结论:LPS和ETO通过中耳黏膜的炎症反应削弱黏液纤毛输送系统的功能,导致OME的发生和迁延。BPI与LPS有特异的亲和作用,抑制LPS导致的炎症反应,恢复有效的黏液纤毛输送系统,而对正常黏膜没有损伤,是一种潜在的治疗和预防慢性中耳炎的有效药物。

杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)模拟肽兔体内拮抗内毒素作用的研究

目的:观察杀菌性/通透性增加蛋白（BPI）模拟肽对内毒素（LPS）血症大白兔的治疗作用。方法:以LPS250μg·KG-1剂量静脉注射攻击日本大白兔制造兔内毒素血症模型,分别于LPS攻击后20秒内静脉注射不同剂量的BPI模拟肽;于LPS攻击前及攻击后不同时间内分别静脉注射5mg·kg-1和10mg·kg-1的BPI模拟肽,并观察BPI模拟肽对LPS攻击所致兔体温。

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。

人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定

目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(600)基因突变体库。方法通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI_(600)随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI_(600)的随机突变率。再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,将质粒进行HindⅢ/XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况。结果测序和基因比对显示,BPI_(600)经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3%;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI_(600),表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI_(600);在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI_(23)编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失。氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变。3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白。结论成功构建pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础。

重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的探讨

目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBPI21剂量为0.625mg/kg)大鼠,6,12h血浆LPS含量明显低于内毒素组大鼠相同时间点LPS含量(P<0.01),血清TNF-α含量各检测时间点均明显低于内毒素组大鼠相同时间点的含量(P<0.01)。与内毒素组大鼠相比,rBPI21治疗2、3、4组(rBPI21剂量分别为1.25,2.5,5.0mg/kg)大鼠各检测时间点血浆LPS、血清TNF-α含量均明显降低(P<0.01)。结论rBPI21对内毒素血症大鼠的保护作用机制主要是通过促进体内LPS的聚合和清除,降低LPS活性,减少TNF-α等细胞因子的过度表达。

杀菌/渗透性促进蛋白与新生儿感染

杀菌 /渗透性促进蛋白 (BPI)是 5 5KDa的阳离子蛋白质 ,存在于中性粒细胞的嗜苯蓝胺颗粒中 ,具有杀菌、中和内毒素 (LPS)等作用。新生儿体内BPI数量较低 ,造成了新生儿抵抗有荚膜包裹的病原体的能力下降 (如大肠杆菌Kl/r) ,从而使新生G -菌脓毒血症的危险增高。