杀鱼爱德华氏菌ETAE_1309基因的启动子研究

为研究杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)ETAE_1309蛋白的表达调控机制,本实验利用序列截短方式和定点突变技术鉴定了ETAE_1309基因的启动子,并检测了不同培养条件下启动子的活性。结果显示:ETAE_1309上游-139~-1 bp具有启动子活性,ETAE_1309的核心启动子为-10元件TATACT和-35元件CTGGCG,该启动子属于σ38依赖型启动子。ETAE_1309转录水平受到RpoS_(Ep)(σ^(38))强烈的正调控,与毒力相关的调控蛋白EsrB、EsrC和与生理过程相关的Fur、CpxR、ETAE_2077对ETAE_1309转录水平影响不大。当杀鱼爱德华氏菌在DMEM培养基中生长时,随着培养时间延长ETAE_1309启动子活性逐渐增加,24 h(稳定期)和36 h(衰亡期)启动子活性分别为12 h(对数期)的2.4倍和2.9倍。当培养温度升高至35℃时ETAE_1309启动子活性显著下降,约为25℃时启动子活性的44.0%。本研究确证了杀鱼爱德华氏菌ETAE_1309的启动子序列及调控蛋白,随着培养时间延长该启动子活性逐渐增加,随着培养温度升高该启动子活性显著降低,研究结果为精准控制ETAE_1309蛋白表达及其介导的细菌毒力奠定了基础。

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)的分离鉴定

从患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝脏中分离到一株优势细菌G1,经人工感染实验表明G1为引发大菱鲆腹水病的致病菌,且半致死浓度为LD50=1.21×105 CFU·g-1。采用常规的生理生化鉴定方法及分子生物学方法对G1进行分析,结果表明,G1的16SrRNA基因序列与杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida的同源性达100%,系统发育分析表明菌株G1与杀鱼爱德华氏菌分支聚为一支,结合生理生化鉴定结果确定G1为杀鱼爱德华氏菌。药敏试验表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸、左氧氟沙星等8种抗菌药物高度敏感。

杀鱼爱德华氏菌新型毒力因子研究进展

杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida,又称迟缓爱德华氏菌),可感染多种重要水产养殖动物,对全球水产养殖业造成巨大经济损失。杀鱼爱德华氏菌具有很强的环境适应性与抗逆性,通过典型的胞内寄生引发严重感染,为研究水产致病菌毒力机制的模型菌株。除T3SS/T6SS系统等典型毒力因子外,近年来又在杀鱼爱德华氏菌中鉴定出众多新型毒力因子。本文主要综述了杀鱼爱德华氏菌一些新型毒力因子(如逃逸宿主免疫杀伤因子、毒素-抗毒素、硫氧还蛋白和蛋白酶类等)以及新型毒力调控因子的研究进展,可为研究该菌致病性提供参考。

60种中草药及其复方对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌效果

【目的】探究60种单方中草药和4种复方中草药水提液对花鲈(Lateolabrax maculatus)源杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)的体外抑菌效果。【方法】首先采用平板打孔法判断中草药有无抑菌作用,然后使用试管二倍稀释法测定具有抑菌效果的14种中药的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),并选择其中部分中药组合,进行复方评价。【结果】苏木(Caesalpinia sappan)的抑菌圈直径可达到约22 mm;分心木(Semen juglandis)、石榴皮(Punica granatum)和番石榴叶(Psidium guajava)的抑菌圈直径均大于15 mm;半枝莲(Scutellaria barbata)和石榴皮的MIC为15.625 mg/mL,蒲公英(Taraxacum mongolicum)和乌梅(Fructus mume)的MBC为31.25 mg/mL。在复方试验中,苏木+半枝莲和地榆(Sanguisorba officinalis)+乌梅的抑菌效果良好,其中苏木+半枝莲效果最佳,抑菌圈直径可达20.13 mm,MIC为31.25 mg/mL,MBC为125 mg/mL;4种复方中草药的联和抑菌指数(Fraction inhibitory concentration index,FICI)显示,联合用药的两种中草药的作用效应均为拮抗。【结论】单方中草药半枝莲、石榴皮、乌梅和蒲公英对杀鱼爱德华氏菌有较强的体外抑菌和杀菌作用。

杀鱼爱德华氏菌非编码小RNA sR082的功能研究

杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是海水养殖鱼类的重要病原菌,给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。前期研究发现杀鱼爱德华氏菌在不同生长环境中有多种sRNA表现出差异表达,其中一个sRNA被命名为sR082。分析了sR082在酸性条件下的表达情况,比较了sR082敲除菌株(TXΔsR082)和野生株TXD1在感染宿主细胞、组织和个体能力方面的差异。结果表明,在低pH值条件下,sR082转录水平显著提高,TXΔsR082生长能力显著降低;与TXD1相比,TXΔsR082在牙鲆细胞内的复制能力、在牙鲆组织中的侵染能力以及对牙鲆的致死能力均显著下降。这些结果表明,sR082很可能在杀鱼爱德华氏菌耐受酸性环境及感染等方面发挥重要作用。

短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用

为探究石榴皮(Punica granatum L.)对花鲈(Lateolabrax maculatus)防控杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)感染的作用,采用石榴皮水提物拌饲(添加量为4、8 g/kg)后连续投喂花鲈(体质量为10.14 g±2.53 g)7 d,分别在投喂3、5、7 d时,检测鱼体血清生理生化指标和免疫相关酶活性,以及脾脏、鳃和头肾组织中免疫相关基因表达量,并用杀鱼爱德华氏菌浸泡感染花鲈,探究石榴皮水提物在细菌侵染鱼体中的防控效果。结果表明:与对照组相比,投喂添加石榴皮水提物饲料的试验组花鲈,随投喂时间延长,血清中总胆固醇、谷丙转氨酶、谷胱甘肽还原酶、乳酸脱氢酶、总蛋白和高密度脂蛋白含量均显著升高(P<0.05),投喂3、5 d时,血糖含量显著降低(P<0.05),碱性磷酸酶(AKP)活性显著升高(P<0.05);脾脏中LZM基因和头肾NK-lysin、LZM基因表达量降低,其余免疫相关基因相对表达量均有所升高;投喂石榴皮水提物混合饲料5 d后,使用杀鱼爱德华氏菌浸泡感染花鲈,其存活率显著提高(P<0.05),说明石榴皮水提物对花鲈的杀鱼爱德华氏菌感染具有良好的防控效果,其中4、8 g/kg石榴皮水提物添加组对花鲈的相对保护率分别为50%和47%。研究表明,投喂石榴皮水提物混合饲料在短期内可有效增强花鲈免疫力和抗杀鱼爱德华氏菌感染力,且显著提高花鲈在杀鱼爱德华氏菌浸泡感染后的存活率。

一种利用λRed重组技术在杀鱼爱德华氏菌基因组添加标签的方法

在杀鱼爱德华氏菌病原学研究中,在动物中制备杀鱼爱德华氏菌蛋白抗体耗时长,且获得的多克隆或多肽抗体在宿主细胞中特异性差,背景信号强。为解决这一问题,对在大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)中建立起来的λRed基因编辑方法进行调整和优化,建立了在杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)基因组基因上添加HA标签序列的方法,为使用标签抗体研究杀鱼爱德华氏菌基因功能提供便利。λRed重组系统利用同源线性DNA片段与基因组DNA进行重组。即以质粒pSU315为模板,在引物上引入目的基因的特异性序列,扩增FRT序列和抗生素抗性基因;以获得的PCR产物转化携带pKD46的杀鱼爱德华氏菌,在pKD46表达的λ噬菌体的3个重组蛋白(Exo、Beta和Gam)作用下,PCR产物与杀鱼爱德华氏菌基因组发生同源重组,获得引入了抗生素抗性的靶基因缺失或靶基因携带标签序列的菌株;接着利用pKD46的温敏型特性,消除引入的pKD46;最后向杀鱼爱德华氏菌引入文章构建的表达Flp重组酶的质粒pKD46-flp,在FLP作用下,两个FRT位点之间发生重组,消除抗生素抗性基因和一个FRT位点,获得携带一个FRT位点序列、靶基因缺失或靶基因添加标签序列的杀鱼爱德华氏菌菌株。该遗传操作平台的建立为杀鱼爱德华氏菌基因功能研究提供便利条件,亦为其他水产病原细菌遗传操作方法的建立提供借鉴。

大口黑鲈杀鱼爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性分析

2022年3月,广东珠三角地区养殖的大口黑鲈(Micropterus salmoides)发生了大规模暴发性死亡,特别是佛山市南海区,死亡率高达20%~50%。为明确大口黑鲈死亡原因,采集佛山市南海区沙头镇腹部膨大和内脏缺血、体长25~35 cm濒死病鱼42尾,进行组织病理分析、病原分离与鉴定、病原菌毒力和耐药性检测等,为该病的诊断和防控提供科学依据。结果显示,病鱼主要临床症状为严重腹水、肝脏和鳃缺血以及肝脏和肾脏肿大。病理切片显示。肝脏和肾脏均严重组织变性和细胞坏死。从肝脾肾组织中均分离出大量菌落形态一致的细菌,其中肝组织细菌丰度最高。生化鉴定和16S rRNA分子鉴定结果表明:细菌S1为杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida),在系统进化树中与杀鱼爱德华氏菌(MN203719.1)自然聚为一支。动物回归感染实验表明该菌为引起大口黑鲈死亡的致病菌,且毒力很强。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素等药物敏感,对利福平、阿莫西林、四环素耐受。

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力和耐药基因检测分析

为探究2019年山东省烟台市某大菱鲆Scophthalmus maximus养殖场出现的以腹水、体表及内脏出血为主要症状的疾病发病原因,通过平板划线法从患病濒死大菱鲆(体质量为350 g±5 g)肝、肾、脾和心等组织中分离获得1株优势菌,采用形态学观察,16S rRNA、gyrB基因和rpoB基因序列分析,PCR特异性引物扩增,以及人工回归感染试验等方法对优势菌进行鉴定,检测其毒力基因、耐药基因携带情况,并采用纸片扩增法(K-B)检测分离株对10类23种抗生素的敏感性。结果表明:从患病鱼分离获得的菌株,生理生化特征为革兰氏阴性杆菌,赖氨酸、鸟氨酸和葡萄糖产酸等试验呈阳性,枸橼酸、精氨酸、蔗糖、甘露醇、苦杏仁苷、尿素、硝酸盐还原和氧化酶等试验呈阴性;经16S rRNA、gyrB基因、rpoB基因序列比对,以及爱德华氏菌特异性引物扩增等鉴定,确定其为杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida;该菌的毒力基因型为fimA+-fimB+-fimC+-fimD+-esrB+-mukF+-katB+-sodB+-citC+-gadB+,耐药基因型为TEM+-ant(3″)-Ⅰ+-tet(A)+-mcr-1+-Sul2+-Sul3--oqxA-;将分离菌株制备成7.8×1010、7.8×109、7.8×108、7.8×107CFU/mL 4个浓度的菌悬液,腹腔注射健康大菱鲆,得到菌株对受试鱼的半致死浓度(LD50)为1.2×108CFU/mL;药敏试验显示,该菌株对磺胺类2种、多肽类2种和利福霉素类1种在内的5种抗生素类药物耐药;对β-内酰胺类5种、氨基糖苷类3种、喹诺酮类5种、大环内酯类1种、氯霉素类1种、四环素类2种和呋喃类1种在内的18种抗生素敏感。研究表明,本试验首次从大菱鲆上检出携带5种耐药基因的杀鱼爱德华氏菌,本研究结果为鱼源耐药性杀鱼爱德华氏菌的分子特性、致病机理和药物防治等研究提供了科学参考。

杀鱼爱德华氏菌双组分调控系统研究进展

杀鱼爱德华氏菌是一种重要的鱼类病原菌,可感染多种重要的经济鱼类,包括海水鱼如大菱鲆、牙鲆、石斑鱼和淡水鱼如罗非鱼等。杀鱼爱德华氏菌致病机制复杂,由多因素构成,其中双组分调控系统(two-component regulatory system,TCS)是其发挥抗逆作用与致病作用的一种重要系统,与细菌抗酸、抗氧化、生物被膜形成、运动性、毒力相关因子的表达等密切相关。当前,杀鱼爱德华氏菌已成为研究水产动物致病菌的一个模式菌株,尽管其致病机制相关研究相对深入,但有关杀鱼爱德华氏菌TCS的研究还很缺乏。为明确TCS在病原菌中发挥的作用,对杀鱼爱德华氏菌TCS的组成、TCS对T3SS/T6SS和其他毒力因子的调控作用与机制以及双组分系统受调控的作用等方面进行了综述,结论表明:(1)TCS对环境应激、T3SS/T6SS、其他毒力因子以及对Mg2+浓度感知和氨基酸途径代谢等方面具有调控作用;(2)EsrA-EsrB系统受到FabR、EvrA的正调控;(3)EsrA-EsrB系统受到RpoS、PepA、MviN、UhpA、EnrR等的负调控;(4)EsrB与Fur存在相互作用。通过综述以上结论,以期能促进相关研究的深入。

中草药对大口黑鲈病原爱德华氏菌的体外抑制效果研究

本文采用水煎法制备10种中草药的水溶性提取物,观察其对大口黑鲈源杀鱼爱德华氏菌的抑制作用。通过琼脂打孔法对其活性进行筛选,并利用酶标仪测定其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果显示:10种水溶性提取物中有5种对杀鱼爱德华氏菌有不同程度的抑制作用,分别为大黄、黄连、黄芩、女贞子和苏木。其中苏木的抑菌和杀菌的效果最明显,抑菌圈直径平均值为21.2 mm,MIC和MBC的浓度分别为7.8125 mg/mL和62.5 mg/mL。该研究为大口黑鲈细菌性疫病的防控提供了新思路。

杀鱼爱德华氏菌新型抗酸系统GadBCD的抗酸作用与致病作用

本研究鉴定了鱼类重要致病菌杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)抗强酸系统GadBCD及其功能。通过序列分析和共转录实验表明:GadBCD系统由1个谷氨酸脱羧酶、1个谷氨酰胺酶和3个转运体组成,它们组成1个操纵子。qRT-PCR发现强酸和高温刺激细菌时gadBCD表达基本不变,但过氧化氢和宿主血清刺激时gadBCD表达显著上调。利用同源重组构建了GadBCD系统缺失突变株ΔgadP,通过比较野生株和ΔgadP的生长曲线以及酸性压力下存活率等实验,发现GadBCD系统不仅是杀鱼爱德华氏菌抗中强酸的重要参与者,也是抗强酸所必需的;通过比较野生株和ΔgadP在生物膜形成、运动性、抗宿主血清杀伤、感染细胞等方面的差异,发现GadBCD参与了细菌的毒力。综上所述,GadBCD系统是杀鱼爱德华氏菌重要的抗强酸系统,并参与了细菌的致病作用。

杀鱼爱德华氏菌质膜蛋白酶HtpX致病作用与受调控研究

杀鱼爱德华氏菌是一种典型的胞内病原菌,能够感染鱼类等多种水产养殖动物,对全球水产养殖业构成巨大威胁.当前对该菌致病机制的认识仍不清晰.质膜蛋白酶HtpX被认为与蛋白酶FtsH一起参与膜蛋白的质量控制,受包膜应激感应调控因子CpxR调控.FtsH和CpxR在杀鱼爱德华氏菌致病过程中发挥重要作用,但HtpX的作用未知.本研究通过构建htpX敲除株发现,杀鱼爱德华氏菌HtpX与细菌耐高温和妥布霉素等环境压力密切相关,发现HtpX参与了细菌运动性和抗宿主血清作用;致病性实验表明,HtpX在细菌对上皮细胞黏附、巨噬细胞内的存活与增殖以及对宿主全局性毒力等方面发挥着重要作用.此外,发现htpX启动子的活性受CpxR的正调控,并可能依赖于CpxR磷酸化水平.本研究为杀鱼爱德华氏菌的生物学特性及致病机制提供了新的见解.

黑棘鲷内脏结节病病原的分离、鉴定及致病性研究

2017年4月,浙江台州某海水养殖公司跑道式养殖池黑棘鲷大量发病,病鱼活力 下降、食欲减退、体表溃疡,剖检可见肝脏、脾脏、肾脏肿大且有不同程度的白色结 节,同时伴随大量腹水。用胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)从典型结节病濒死黑棘鲷器官分离 到革兰阴性短杆菌。分离病原菌AS15对健康黑棘鲷的致病力结果显示,AS15腹腔注射 可使健康黑棘鲷发病死亡,死亡黑棘鲷可出现自然发病症状,在(24±1) °C的条件下,(25±2) g 黑棘鲷的半数致死浓度(LD50)为6.5×104 CFU/尾。经API 20E鉴定,分离菌株AS15生理生 化特性与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和迟缓爱德华氏菌典型菌ATCC15947相似度为 86.2%,与杀鱼爱德华氏菌ETT883的相似度为82.8%;AS15的16S rDNA与杀鱼爱德华氏 菌ETT883同源性达99%,gyrB与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和杀鱼爱德华氏菌 ETT883同源性分别为100%和98%;16S rDNA进化树显示,AS15与ETT883、LADL05- 105聚为一簇,gyrB进化树与LADL05-105、NCIM2056聚为一簇;采用4种爱德华氏菌属 种特异性引物对AS15进行PCR分析,结果显示,AS15可扩增出类杀鱼爱德华氏菌的种特 异性片段,不能扩增出迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌、杀鱼爱德华氏菌的种特异性 片段,表明AS15属类杀鱼爱德华氏菌成员。分析了AS15的菌毛基因、sodB等毒力基 因,发现AS15具有fimA、fimB、fimC、fimD等4种菌毛基因和sodB、citC、esrB、mukF、 katB等毒力基因。本实验首次从黑棘鲷上检出致病性类杀鱼爱德华氏菌,该菌对黑棘鲷 的发病机制和毒力机理还需进一步研究。