大西洋鲑杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和致病性研究

杀鲑气单胞菌为气单胞菌属(Aeromonas)革兰阴性短杆菌,可导致鲑鳟鱼类发生疖疮病或溃疡病。患病鱼的典型症状表现为体侧或尾部形成特征性脓肿,严重时脓肿部位溃烂形成溃疡,剖检可见肝脏、脂肪组织出现点状出血[1]。已有研究表明,杀鲑气单胞菌包括多个亚种如无色亚种(Achromogenes)、杀鲑亚种(Salmonicida)、杀日本鲑亚种(Masoucida)、史氏亚种(Smith)和溶果胶亚种(Pectinolytica)等[2],

养殖大菱鲆病原菌——杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和组织病理学研究

自然发病的养殖大菱鲆幼苗出现口部周围皮下出血,肝脏灰白色并萎缩坏死的症状。从肝脏中分离纯化得到优势菌株,定名为db14。该菌株在LB培养基上生长较缓慢,早期菌落稍隆起,白色,质地较硬;人工感染试验证实对大菱鲆有较强的致病性,其半数致死剂量LD50为2.75×103cfu/g;生理生化特征测定显示其与杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.achromogenes)相似度最高;细菌16S rDNA序列测定后在GenBank中进行序列比对分析,结果与杀鲑气单胞菌无色亚种的序列同源性最高,为100%。综合上述结果,确定该菌株为杀鲑气单胞菌无色亚种。该菌株对复达欣、菌必治、丁胺卡那霉素和氯霉素等较为敏感。通过对人工感染菌株db14的大菱鲆组织切片观察,发现病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道等器官的组织均有明显的病理变化,而心脏和脑未发现明显异常。

斑点叉尾源杀鲑气单胞菌无色亚种分离鉴定及药敏特性

研究从患溃疡症斑点叉尾鲙中分离到一株致病性菌株ry01,生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析表明ry01株为鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾鲙的半数致死量为4.17×10~6 CFU/m L。菌株ry01对强力霉素及左氧氟沙星等高度敏感,为斑点叉尾鲙该病防控提供了理论依据。

鲤源杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定及毒力基因检测

为了解引起鲤鱼皮肤溃疡的病原分子分型特征及其毒力基因,从患溃疡症鲤鱼体内分离到1株致病性菌株GZGY2019,鉴定其为气单胞菌,并运用多位点序列分型(MLST)方法进行分类研究,利用PCR和测序方法分析6种毒力基因Aer、Ser、Alt、Lip、Act和Hly。通过对分离株的16S rDNA基因进行分析,确认其属于杀鲑气单胞菌。分离株对复方新诺明等9种抗菌药物耐药,毒力基因扩增结果显示:分离菌能检出气溶素基因(Aer)等6种毒力基因。基于气单胞菌6个管家基因分析,与MLST数据库中等位基因序列比对,发现其属于新的序列型(ST),隶属于杀鲑气单胞菌无色亚种。这一研究对发病鲤鱼的病因进行了准确诊断,为该病的防治与分子流行病学研究提供了依据。

石鲽(Kareius bicoloratus L.)源杀鲑气单胞菌杀鲽亚种生物学性状的研究

采用分类方法,对从两起石鲽(KareiusbicoloratusL.)细菌性败血感染症病例的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行形态特征、培养特征、自凝性、色素产生情况及生理生化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中(G+C)%的测定等研究。结果表明,分离菌为杀鲑气单胞菌的新亚种(subsp.nov.)并定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种(Aeromonassalmonicidasubsp.flounderacidasubsp.nov.)。经血清型检定,表明60株菌均为同种血清型。选择代表菌株做对健康石鲽、牙鲆、鲤、鲫及泥鳅的人工感染试验,表明了相应的原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果表明,对供试37种抗菌药物中的青霉素G等6种耐药,对头孢噻肟等25种高敏,对多黏菌素B、利福平2种敏感,对头孢唑啉等4种在株间存在一定敏感性差异。该研究结果能较全面地反映出该菌的主要生物学性状。

杀鲑气单胞菌一新亚种的生物学特性及系统发育学分析

从石鲽(Kareius bicoloratusL.)细菌性败血感染症的病鱼(濒死及死亡不久)中分离到相应病原菌,进行形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中G+C mol%的测定。同时,选择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定,测定16S rRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性,构建系统发生树。结果表明,分离鉴定的60株菌为杀鲑气单胞菌的一个新亚种(subsp.nov.),定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.flounderacidasubsp.nov.)。代表菌株HQ010320-1及HQ010320-5的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的杀鲑气单胞菌的同源性在99%和100%

杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种胞外产物毒性及免疫原性分析

用玻璃纸平板法提取了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Aeromonassal monicida masoucida的胞外产物(ECP)。毒性试验证实,ECP对剑尾鱼Xiphophorus helleri具有致死性,其半致死量(LD50)为4.72μg蛋白/g体重。SDS-PAGE表明,ECP由13条蛋白带组成。利用大鼠抗ECP血清进行的Western-blot印迹显示,组成ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性,能够引发机体的免疫应答反应产生抗体,其分子量分别为88、70、42、39、36、22和15kDa。

细鳞鱼杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离鉴定

为确定吉林省某渔场细鳞鱼发病死亡的病因,本研究由濒死的细鳞鱼体内分离出一株优势菌,经动物回归试验,该菌株对细鳞鱼具有致病性,将其命名为BRL-15。经菌体、菌落形态,理化特性,16S rRNA基因序列分析,鉴定菌株BRL-15为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。药敏试验结果显示,该菌株对所选抗菌药物中绝大多数高度敏感。试验结果为细鳞鱼杀鲑气单胞菌病的防治提供一定理论依据。

河川沙塘鳢病原杀鲑气单胞菌致病性及感染后宿主免疫相关基因差异表达分析

为探明2021年3月常熟某养殖场河川沙塘鳢(Odontobutis potamophilus)疾病暴发的原因,本研究从患病鱼体内分离到优势菌株,通过形态观察、理化特性测定及gyrB基因同源性分析鉴定优势菌,同时通过人工感染试验、组织病理观察、毒力因子及毒力基因检测确定其致病性,并测定分离菌的耐药性和感染后河川沙塘鳢免疫相关基因表达变化。结果显示:引起河川沙塘鳢大量死亡的病原菌为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。代表菌株G2-4-1对河川沙塘鳢的LD 50为1.8×106 CFU/mL;该病原菌感染可引起河川沙塘鳢肝脏、脾脏、肾脏和鳃组织出现明显的变性、坏死和炎性细胞浸润;该菌株携带aer、hly、exu等毒力基因,且具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明胶酶和溶血素活性,但不具有DNA酶活性;耐药性分析发现,分离菌G2-4-1对青霉素G、氨苄西林、苯唑西林等8种药物耐药,对克拉霉素和大观霉素2种药物中介,对恩诺沙星、氟苯尼考等24类药物敏感;免疫相关基因表达分析显示,在感染初期MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD在鳃、脾脏和肾脏组织中都显著上调表达。

杀鲑气单胞菌对亚东鲑血液免疫指标的影响

为预防杀鲑气单胞菌在亚东鲑养殖过程中造成的危害,以杀鲑气单胞菌为研究对象,通过感染亚东鲑,检测其对亚东鲑免疫指标的影响。结果表明:GR组亚东鲑血清中白细胞介素1β(IL-1β)含量随感染时间增加显著性上升(p<0.05),免疫球蛋白A(Ig A)含量也呈现上升趋势,而转化生长因子β1(TGF-β1)含量则表现出相反趋势,其含量显著性降低(p<0.05);GR组血常规指标中除血小板分布宽度(PDW)外,其它指标均在48h呈现显著性降低(p<0.05),除红细胞压积(HCT)外,其它指标均在96 h呈现上升趋势。杀鲑气单胞菌能够引发亚东鲑炎症反应,导致IL-1β和IgA含量升高,TGF-β1含量降低;在感染亚东鲑48 h能够破坏其免疫系统,导致白细胞、红细胞及血小板等数目显著性减少。

长江上游网箱养殖圆口铜鱼杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离与鉴定（英文）

研究首次报道了圆口铜鱼(Coreius guichenoti)疥疮病,从患病圆口铜鱼的肝脏中分离到优势菌株YTL1,并运用形态学观察、生理生化检测、16S rRNA和6个管家基因的系统发育分析等对分离菌株进行鉴定。基于以上实验结果,YTL1被最终鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。通过标准Kirby-Bauer纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验,筛选治疗该暴发病的有效药物,结果显示YTL1对氟苯尼考,诺氟沙星和氨苄青霉素等13种抗生素敏感,对6种抗生素如杆菌肽,链霉素和卡那霉素有耐药性,对红霉素具有中等敏感性。因此,氟苯尼考被建议用来伴饵投喂,并取得了较好的疾病控制效果。草鱼幼鱼(Ctenopharyngodon idella)和斑马鱼(Danio rerio)的人工感染试验结果显示,经腹腔注射7.6×106—7.6×108 CFU/mL的YTL1菌液后,感染鱼的症状与患病圆口铜鱼症状相似。研究证明基于6个管家基因的多序列位点分型是鉴定杀鲑气单胞菌至亚种水平的一种有效方法,杀鲑气单胞菌是圆口铜鱼人工养殖的最大威胁之一,并发现鲤科鱼类,如草鱼和斑马鱼均是杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的易感宿主。

一例草鱼源杀鲑气单胞菌的检测分析

2023年4月,大丰某草鱼养殖场暴发病情,草鱼出现了死亡现象,个体长度25厘米左右,部分濒死草鱼出现眼球突出、体表溃烂、鳍条基部充血等症状。从濒死的草鱼肝脏和肾脏中分离纯化获得一株优势菌株,并利用生理生化和分子生物学方法对该优势菌进行鉴定分析和药敏试验,旨在为养殖生产中草鱼的疾病防治提供参考依据。

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp.masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5μL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法,该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑。

1株杀鲑气单胞菌杀鲑亚种对甲酸乙酯的降解研究

甲酸乙酯广泛存在于化工行业的废水中,对生物体及环境都具有很大的危害。微生物降解是处理甲酸乙酯的重要方法之一。采用富集培养法和平板划线法从活性污泥中筛选出一株能降解甲酸乙酯的菌株ETH-3。经形态观察、生理生化试验和16S rDNA鉴定,确定该菌株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。通过摇瓶实验测定菌株ETH-3的最佳生长环境条件以及其对甲酸乙酯的降解能力,结果表明,该菌株最佳生长温度为25-30℃、最佳生长pH为8左右。该菌株具有较强降解甲酸乙酯能力,在30℃时,36 h内对0-10 500 mg/L的甲酸乙酯可达完全降解。经GC-MS对代谢产物的分析发现,甲酸乙酯会先被微生物代谢为甲酸和乙醇,后甲酸和乙醇会被微生物进一步降解为CO2和H2O。

养殖刺参溃疡病杀鲑气单胞菌的分离、致病性及胞外产物特性分析

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参的LD50为5.24μg蛋白/g体质量。H1-ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、几丁质酶和淀粉酶活性,并具有溶血素活性;对底物偶氮酪蛋白(Azocasin)作用的酶比活力可达到674.5活力单位/mg蛋白,最适作用温度为50℃;对热不稳定,70℃作用30 min时,酪蛋白酶活性降到0;100℃作用30 min,ECP对刺参的毒性消失;ECP酶活可被10 mmol/L EDTA完全抑制,可被5 mmol/L PMSF抑制98.8%,Ca2+和Mg2+可使酶活性分别提高约9%和4%。结论认为,该病原菌通过体表创伤侵入方式感染宿主刺参,菌株H1胞外产物是其对刺参致病的因子之一。

温度及pH对杀鲑气单胞菌生长的影响研究

利用 A 值法与活菌平板计数法,测定了杀鲑气单胞菌在不同条件下的生长曲线,研究了不同温度及pH对杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicha）生长的影响。结果表明,活菌计数法更能真实的反映细菌数量的动态变化。在28℃,15℃,10℃,5℃条件下,随着温度降低,杀鲑气单胞菌生长速率明显下降；在pH6.0-8.0时,酸性条件能明显抑制杀鲑气单胞菌的生长；在28℃、pH7.5条件下,杀鲑气单胞菌生长速率最快,达到稳定期时细菌数量也最多。在养殖生产过程中,为了抑制杀鲑气单胞菌的生长繁殖,建议在不影响鱼类正常生长的条件下,尽量降低养殖水体温度并合理控制水体pH,以降低养殖鱼类发病率。

大西洋鲑杀鲑气单胞菌的分离鉴定

从皮肤溃烂的大西洋鲑(Salmon salar)肌肉、肝、肾分离到一致病性的菌株(AB080226),经人工感染实验证实其为该病的病原菌,研究了该菌的形态、生理生化特征并对其16SrDNA序列进行了在线Classifer和Blast分析。结果显示:该菌为革兰氏阴性杆菌,葡萄糖氧化发酵阳性,氧化酶检测阳性,0%NaCl生长;能利用甘露醇,不具运动性,能发酵麦芽糖,葡萄糖产酸阳性,精氨酸双水解酶阳性,苯丙氨酸脱氨酶阴性;该菌属于气单胞菌属的细菌,在系统发育树上与杀鲑气单胞菌形成一个簇群,同源性高达99.9%以上。综合形态学、生理生化特征及16SrDNA序列鉴定其为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。

患病细鳞鱼杀鲑气单胞菌的分离与鉴定

从患病细鳞鱼(Brachymystax lenok)的病变组织处分离到1株致病菌,经过分离培养,生化鉴定,16 S rRNA序列分析和人工感染实验确定该病原菌为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。采用20种药物进行药敏分析,结果显示:分离菌株对阿米卡星、哌拉西林、恩诺沙星等9种抗生素敏感;对环丙沙星、诺氟沙星等4种抗生素中度敏感;对卡那霉素、青霉素、氨苄西林等7种抗生素耐药。

羊源杀鲑气单胞菌16S rRNA基因的克隆测序及分析

从重庆市丰都县无菌采集山羊血液,提取全血基因组,用16SrRNA基因的引物进行PCR扩增,得到2条长约1 500bp的扩增片段,将其克隆到pMD19-T载体后进行测序,并与3条豚鼠气单胞菌,3条嗜水气单胞菌,3条中间气单胞菌,4条杀鲑气单胞菌,2条温和气单胞菌,3条维氏气单胞菌和5条舒氏气单胞菌16SrRNA基因序列进行系统发育分析.结果表明:所克隆的基因片段长度均为1 507bp,GenBank登录号为JF823571和JF823572.系统发育分析发现2条序列均被聚类到杀鲑气单胞菌群,并与温和气单胞菌聚类到一个大的分支.同源性比对结果显示所获得的序列与杀鲑气单胞菌法国株(ATCC33658T)X74681和阿根廷株AF134065的同源性最高,均为99.6%,表明重庆地区存在受杀鲑气单胞菌感染的山羊.

半滑舌鳎溃疡病原杀鲑气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)是广受我国消费者认可的名优鱼类,具有很高的营养价值和经济价值,然而,随着工厂化养殖模式的不断发展,疾病成为制约半滑舌鳎养殖业健康发展的关键因素,其中,体表溃疡病为其常见病症。从严重溃疡病半滑舌鳎体内分离到1株优势菌株HX0416,该菌可在TCBS培养基上生长,并可在绵羊血平板上形成清晰的β-溶血环;经过16S rRNA和rpo D基因序列同源性分析并结合生化特性鉴定为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。健康半滑舌鳎幼鱼感染试验表明,该菌对半滑舌鳎具有较强致病性,感染72 h(1.04×106cfu·m L-1)对攻毒鱼的致死率达91.7%。药敏试验结果显示,该菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等喹诺酮类和头孢曲松、头孢吡肟等头孢菌素类药物比较敏感,而对硫酸新霉素、土霉素等氨基糖苷类和四环素类药物多重耐药,尤其是对磺胺甲噁唑、氨苄西林等磺胺类和β-内酰胺类药物严重耐药。