多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。

尼罗罗非鱼X和Y染色体原位杂交探针的制备

通过染色体显微切割的方法 ,分别从尼罗罗非鱼XX和YY个体有丝分裂中期相染色体滴片上 ,割取第 1对染色体 ,随后经简并PCR扩增 ,分别用生物素和地高辛标记 ,得到X和Y染色体探针。将探针与尼罗罗非鱼XY个体的染色体进行荧光原位杂交 ,在第 1对染色体上得到很强的杂交信号。结果表明 ,染色体显微切割和简并PCR技术相结合 ,可以有效地制备鱼类DNA探针。

荧光杂交探针技术检测单核苷酸多态性

目的建立一种基于荧光杂交探针技术快速检测单核苷酸多态性方法。方法提取线粒体DNA,在LightCycler仪器上进行实时PCR和熔解曲线分析,测序验证。结果熔解曲线分析获得的150个基因型分析结果与测序结果100%一致。结论实时PCR和杂交探针技术能快速、有效的检测单核苷酸多态性。

从YAC DNA制备荧光原位杂交探针的新方法

介绍了一种新的ＹＡＣ ＤＮＡ的回收方法。该方法先用脉冲电泳分离并回收ＹＡＣ条带，然后连接引物用ＰＣＲ扩增ＹＡＣＤＮＡ。这一方法回收的ＹＡＣＤＮＡ一是量多，节省制备探针的时间；二是产物总的染色体跨度大，有利于染色体原位杂交。经ＦＩＳＨ（荧光原位杂交）鉴定证明该方法得到的ＹＡＣＤＮＡ对ＹＡＣ的定位和嵌合的鉴定非常有效。

杂交探针技术结合熔解曲线鉴别川贝母与伊贝母的研究

目的建立一种快速、准确鉴别川贝母和伊贝母的方法。方法针对川贝母与伊贝母的ITS1基因特异性位点设计杂交探针,采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增特异性片段,将其与探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过实时PCR仪绘制目标DNA片段扩增过程中的熔解曲线,根据熔解温度(Melting Temperature,T_m)对川贝母正伪品进行分析。结果两种贝母的熔解曲线、T_m具有特异性,通过该方法可以有效鉴别出川贝母和伊贝母,模版DNA最低检出限达到了0.2 pg,具有较高的灵敏度。结论该技术可用于川贝母质量控制,可作为《中国药典》方法的有效补充,对其他疑难品种的鉴别具有借鉴作用。

DNA杂交探针检测蚤(蚤目:蚤科和角叶蚤科)体中鼠疫菌应用

尽管从跳蚤种群中分离鼠疫菌是确定该微生物存在的最可靠方法,但用作分离蚤体内细菌的活体动物试验毕竟是费时和耗资的。由于鼠疫菌特有的毒力抗原表达受温度控制,通常能检测哺乳动物中细菌的血清学方法便不能识别蚤体中的感染。因此,通常将野外收集蚤于盐水中研磨并接种小鼠。

应用EBER-RNA探针原位杂交技术在鼻咽癌组织中EB病毒的检测效果

分析EBER-RNA探针原位杂交技术在鼻咽癌组织中EB病毒的检测效果。方法 选取2022年1月-2022年12月本院100例疑似鼻咽癌患者,所有患者经病理组织检查确诊,术中提取病灶组织,通过EBER-RNA探针原位杂交技术对不同组织中EB病毒进行检查,分析检查结果。结果 鼻咽癌患者病灶组织中EB检出率较非鼻咽癌患者组织检出率高(P<0.05)。鼻咽癌患者EB病毒检出率肿瘤类型及发病位置存在显著差异(P<0.05)。经多因素分析,鼻咽癌患者EB病毒检出率与肿瘤类型、发生部位及性别等有关。结论 鼻咽癌组织中EB病毒检测过程中,EBER-RNA探针原位杂交技术应用价值较高,其可以将病情严重程度清楚反映出来,为临床治疗提供参考,值得采纳。

荧光原位杂交探针在腺泡状软组织肉瘤诊断中的应用

腺泡状软组织肉瘤是一种好发于儿童和青年的罕见恶性软组织肉瘤，主要症状为缓慢生长的软组织肿块，多数患者在诊断数年后出现远处转移，预后差。腺泡状软组织肉瘤的肿瘤组织中存在特异性基因非平衡易位：der（17）t（X；17）（p11.2；q25）［1-2］，即Xp11.2处TFE3端粒侧基因经复制后易位至17q25位点，并与该位点着丝粒侧的ASPL基因融合形成ASPL-TFE3基因，同时原X染色体是完整的，而17 q25端粒侧基因丢失。根据腺泡状软组织肉瘤特有的基因改变，我们设计了一种荧光原位杂交（ FISH）多克隆探针，用来判断肿瘤组织内是否存在TFE3基因的非平衡易位，提供了一种诊断腺泡状软组织肉瘤的新方法。

人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建及其应用

目的 构建人软骨蛋白聚糖 (aggrecan)探针 ,应用于整复外科研究中Northern法对aggrecanmRNA表达水平的检测。 方法 取人软骨细胞 ,逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR )扩增ag grecan球间区域 (IGD)片段。将纯化的RT PCR产物构建入 pUCm T载体 ,酶切及测序鉴定。32 P标记aggrecan探针 ,Northern杂交法检测人软骨组织和培养软骨细胞 (各 3组 )以及人正常和瘢痕疙瘩成纤维细胞 (各 6组 )中aggrecanmRNA的表达。 结果 构建产物经鉴定 ,显示其包含了人ag grecanIGD的基因序列 ,与GeneBank已收录序列 (M 5 5 172 ) 10 0 %相同。Northern结果显示 ,该探针可用于aggrecanmRNA表达水平的定性和定量检测。对正常人软骨组织和体外培养人软骨细胞的aggrecan β actin的吸光度比值进行比较 ,发现其间 ( 0 .5 75 6± 0 .0 15 2 1.36 90± 0 .0 2 0 6 )差异具有显著性 (P <0 .0 1)。结论 Northern杂交法可以对整复外科研究中常见的软骨和瘢痕疙瘩成纤维细胞中aggrecanmRNA的表达水平进行检测 ,且具有较好的灵敏度和特异性。

聚合酶链反应结合探针杂交检测军团菌

利用来源于嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强因子（ｍｉｐ）基因序列的引物，建立了快速检测军团菌的聚合酶链反应技术。扩增反应产物经与地高辛标记的特异寡核苷酸探针杂交证实。用本方法检测接种过军团菌的支气管肺泡灌洗液标本，可检出１００ＣＦＵ／ｍｌ细菌。研究表明它是军团病诊断的一种有效手段。

荧光探针杂交技术检测临床标本内结核分支杆菌的价值

目的 评价聚合酶链反应 (PCR)荧光探针杂交技术 (TaqMan技术 )检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法 应用细菌学方法(涂片镜检和培养 )及TaqMan法检测 1 3 3份结核病患者痰标本 ,5 3份非结核呼吸系疾病患者痰标本。结果 细菌学方法检测结核病患者临床标本中结核分支杆菌阳性率为 3 6.1 % ,TaqMan法阳性率为 61 .7% ,高于细菌学检测法 ,经统计学处理 ,两者有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,用TaqMan法检测临床标本特异性为 96.2 %。 结论 TaqMan技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化 ,在单一管内完成 ,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性较高等优点 ,是结核病辅助诊断的有效方法之一。

反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究

目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse lineprobe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3’、5’对称加有poly-C的特异性探针和5’标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5%以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100%,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09%(103/105)、100%(43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.

聚合酶链反应-探针杂交-酶显色用于结核分支杆菌的检测

目的 评价聚合酶链反应 探针杂交 酶显色方法 ,检测结核分支杆菌。方法 收集 131例活动性肺结核患者和 30例非结核呼吸系疾病患者的痰标本以双盲法进行痰涂片抗酸染色检查 ,结核菌培养、PCR 探针杂交 酶显色法、PCR 琼脂糖凝胶电泳技术检查对比。结果 涂片法、培养法、PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性分别为 2 6 72 %、4 1 2 2 %、70 2 3% ,PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性显著高于培养法和涂片法 (P <0 0 1)。PCR 探针杂交 酶显色法和PCR琼脂糖凝胶电泳法的敏感性分别为 70 2 3%、70 99% ,特异性分别为 96 6 7%、86 6 7% ,前者特异性比后者高 ,且PCR 探针杂交 酶显色法只检出结核分支杆菌和牛型分支杆菌。结论 PCR 探针杂交 酶显色技术检测结核分支杆菌灵敏度高 ,特异性好 ,简便快速 ,同时能筛检非结核分支杆菌。因此 。

分子线性探针杂交法在结核分枝杆菌耐药性快速检测中的应用价值

目的探讨分子线性探针杂交法在快速检测结核分枝杆菌耐药性中的效果。方法选择新乡医学院第一附属医院住院治疗的结核患者的临床标本750例,其中结核分枝杆菌临床分离株190例,痰涂片阳性标本560例。所有临床标本分别采用传统方法及分子线性探针杂交法进行检测,对2种方法检测的异烟肼(INH)和利福平(RFP)的耐药结果进行比较,采用分子线性探针杂交法对耐药菌株进行基因分型,分析INH及RFP耐药相关突变位点情况。结果传统方法检测中,560例痰涂片阳性标本中共检测出结核分枝杆菌454例,其对INH、RFP耐药率分别为15.0%(68/454)、17.8%(81/454),190例结核分枝杆菌临床分离株对INH、RFP的耐药率分别为26.8%(51/190)、18.4%(35/190);传统方法检测的结核分枝杆菌对INH、RFP的耐药率分别为18.5%(119/644)、18.0%(116/644)。分子线性探针杂交法检测454例结核分枝杆菌对INH、RFP的耐药率分别为14.1%(64/454)、17.6%(80/454),190例结核分枝杆菌临床分离株对INH、RFP的耐药率分别为23.2%(44/190)、16.3%(31/190);分子线性探针杂交法检测的对INH、RFP的总耐药率分别为16.8%(108/644)、17.2%(111/644)。2种方法检出的结核分枝杆菌对INH、RFP的耐药率比较差异无统计学意义(INH:χ~2=0.140、0.691、0.650;RFP:χ~2=0.011、0.293、0.131;P>0.05)。分子线性探针杂交法检测中,对INH和RFP的灵敏度、特异度分别为85.7%、98.9%和90.5%、98.9%,其中kat G-S315T1为INH耐药主要突变位点,约占88.9%,rpo B-S531L为RFP耐药主要突变位点,约占81.1%。结论分子线性探针杂交法能够快速检测出结核菌株和痰标本中结核分枝杆菌的耐药性,并能对耐药基因进行分型,减少药物敏感性试验的时间,并能根据药物敏感性结果尽快采取有效的治疗方案。

反向线性探针杂交在检测实验动物沙门菌中的研究

目的建立简便、快速、准确、灵敏、特异的沙门菌检测方法。方法根据沙门菌argT基因序列设计通用引物和3'、5'均加有polyC的特异性探针。上游引物5'标记生物素,将探针线性固定在硝酸纤维素膜上,使沙门菌PCR扩增产物与探针进行杂交,通过优化杂交条件,建立反向线性探针杂交检测方法。利用该方法对重庆地区74只实验动物进行检测,同时与传统分离培养方法比较。结果反向线性探针杂交方法灵敏度高,对沙门菌PCR扩增产物在3ng/μL以上可有效检测。从细菌分离培养及DNA提取到PCR扩增及反向杂交结束仅需27h。该检测方法特异性高,对6种非沙门菌的检测中,其特异性为100%。应用传统分离培养方法和反向线性探针杂交方法分别检测42只KM小鼠和32只SD大鼠,两种方法检测结果一致性为100%。结论反向线性探针杂交检测方法,具有快速、可靠、敏感和特异的特点,可用于沙门菌感染时的检测,适合应用于实验动物沙门菌的监测。

用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列,设计并合成了探针MG和MS共同目的基因,跨幅为580bp的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的MS菌株DNA模板进行聚合酶链反应(PCR),结果得到了预期大小约580bp的PCR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝胶中的MG扩增产物克隆至T载体中,DIG随机引物法合成核酸探针,斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性,检测灵敏度分别为2ng和3ng,其它对照菌(毒)株为阴性。

荧光探针杂交-聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的 建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交 聚合酶链反应 (PCR)方法。方法 利用TaqDNA聚合酶的 5’ 3’核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针 ,导致荧光强度的改变 ,通过检测荧光强度分析PCR扩增产物。结果 选用 13株常见致病性沙门菌和 7株非沙门菌进行特异性分析 ,所有沙门菌的荧光△RQ值介于 3～ 8之间 ,而所有非沙门菌的荧光△RQ值均小于 1;在敏感性分析中 ,采用菌落CFU计数法 ,最低限度可检测到每PCR扩增体系中含 2 .2 5CFU的沙门菌 ;与传统细菌培养鉴定方法对照 ,对 4 0份各种标本进行沙门菌的检测 ,结果该方法的特异性为 10 0 % ,敏感性为 93.1% ,两种方法的符合率为 95 %。结论 用荧光探针杂交 PCR检测沙门菌 ,是一种快速。

应用特异性核酸探针杂交分析法进行献血员HLA分型的初步报告

目的 探讨利用特异性核酸探针杂交分析法检测HLA等位基因的可行性。方法 10例西南某地献血员 ,提取DNA后经PCR扩增 ,采用酶联探针免疫杂交分析法检测HLAⅠ和HLAⅡ等位基因。结果 10例标本经检测HLAⅠ和HLAⅡ等位基因 ,表现为A 0 2、A 2 4、A 11、B 3 5、B 15、B 5 1、B 5 2、B 40、DRB1 110 1、DRB1 0 90 1、DQB1 0 3 0 3、DQB1 0 3 0 1等类型 ,为常见蒙古人种类型。结论 利用特异性核酸探针杂交分析法可方便快速地对HLA分型 ,值得推广使用。