利用家蚕-HyNPV表达系统表达鼠抗人CD28分子单链抗体

人CD28分子是T细胞表面的最重要的协同刺激分子。将抗人CD28的鼠源单链抗体基因(mouse anti-human CD28-ScFv)亚克隆至杂交病毒HyNPV Bac-to-Bac系统供体质粒pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFast-BacHTa CD28-ScFv,并转化大肠杆菌(E.coli)DH10Bac获得重组杆粒rBacmid CD28-ScFv,脂质体介导转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBV CD28-ScFv。该重组杆状病毒注射接种于家蚕5龄起蚕,经SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,CD28-ScFv在家蚕体内得到了表达,即:人CD28单链抗体通过HyNPV这一宿主范围扩大的新型杂交杆状病毒表达载体在家蚕中获得了表达。

鼠抗人B7-2分子单链抗体基因的构建及其在家蚕中的表达

B7-2蛋白为免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一。采用PCR法从分泌鼠抗人B7-2抗体的杂交瘤细胞株克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因间引入连接肽(Gly4Ser)3编码序列,体外构建抗人B7-2的鼠源单链抗体基因B7-2-ScFv。利用新型杂交病毒HyNPV的Bac-to-Bac表达系统,将B7-2-ScFv基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-B7-2-ScFv,转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-B7-2-ScFv。将此重组杆粒的DNA转染Sf9细胞,获得重组病毒HyNPV-ScFv。感染该重组病毒的BmN细胞经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,至感染24h时目的蛋白已有表达,96h达到最高表达水平,表达产物的分子质量约31kD。用该重组病毒感染家蚕5龄起蚕,感染后96h蚕体表现出明显的发病症状。RT-PCR结果表明,5龄起蚕感染后48h,在脂肪体内已有目的基因转录,一直持续到感染后120h;SDS-PAGE和Western blotting分析表明,5龄起蚕感染96h后方可在脂肪体中检测到目的蛋白表达。构建并在家蚕中成功表达鼠抗人B7-2单链抗体,为深入研究和开发该抗体奠定了基础。