一种点杂交膜预处理方法的建立及应用

旨在解决手工点样斑点杂交中样品点密度小、点样体积受限制和点样点不规整等问题,建立了一种新的点杂交膜预处理方法。首先根据预设点样点的大小、排列方式和密度,制作柱状凸起模具;其次将模具固定于杂交膜上,使模具凸起部位与膜紧密接触;再将熔化的石蜡涂布于膜上非模具接触部位,待石蜡凝固后移走模具,获得预处理杂交膜。以荧光染料IRDye800标记的抗体为样品进行直接点样检测,同时提取水稻、小麦和大豆的蛋白进行点杂交实验验证。结果显示,利用上述方法得到非点样部位具有疏水性的预处理NC膜和PVDF膜,其点样点位置、形状和大小固定,点样密度高。不同体积荧光染料标记抗体直接点样得到的荧光图像整齐规范,水稻、小麦和大豆蛋白与水稻看家蛋白抗体Anti-HSP杂交后均能检测到稳定信号。杂交膜经预处理后可最大限度实现点样点位置、大小和形状的统一,并能显著提高上样体积和点样密度。

PCR-荧光法与PCR-膜杂交法在检测HPV-DNA中的比较分析

分析PCR-荧光法与PCR-膜杂交法在检测HPV-DNA中的比较。方法 选取HPV-DNA检测的女性患者114例,时间为2020年7月-2022年7月。所有患者在明确细胞学诊断的基础上,分别采用PCR-荧光法和PCR膜杂交法检测HPV-DNA,比较各组HPV-DNA阳性率。结果 细胞学诊断结果显示,所选114例患者中,85例细胞正常,29例细胞异常。其中15例为ASC-H,12例为低级别鳞状上皮增生,1例为 HSIL,1例为 HSIL。、SCC(宫颈鳞癌)1例。HPV-DNA检测结果显示,细胞正常组与细胞异常组相比,用PCR-荧光染色及PCR-膜杂交方法对大肠癌的检出率,经统计学处理,均有统计学意义, P<0.05。PCR-荧光和PCR-膜杂交分别为12.94%和28.24%,二者相比,有显著差异,P<0.05。细胞异常组中,PCR-荧光和PCR-膜杂交分别为93。10%和96 5%,P>0.05。结论 在HPV-DNA检测当中,PCR核酸扩增检测技术的灵敏度、特异度都比较高。其中PCR-荧光法在临床筛查诊疗当中应用价值更高,PCR-膜杂交法在非高危性HPV检测及科研方面优势更明显。临床上对于HPV诊断可采取细胞学检查与HPV-DNA检测联合应用的方法,可以使准确性大大提高,为临床提供充分依据。

膜杂交多重检测技术在HPV基因分型中的应用

目的 应用膜杂交多重检测技术进行人乳头瘤病毒（HPV）基因分型诊断，以了解HPV亚型的感染状况。方法采用膜杂交多重检测技术对深圳地区不同年龄段就诊妇女4419例进行23种HPV基因亚型检测。结果4419例标本共检出HPV亚型感染阳性者897例，阳性率为20．3％；其中高危型感染649例，低危型感染183例，混合感染65例，分别占总阳性的72.4％，20．4％和7．2％。不同年龄组的HPV亚型感染检出率差异明显，〈20岁，20～35岁，36～50岁和〉50岁年龄组的HPV亚型感染阳性率分别为2.3％，70．1％，22．0％，5．6％；各年龄组低危型和高危型感染阳性率分别为0．9％和1．4％，17、0％和53．1％，5、3％和16、7％，0和5．6％。结论膜杂交多重检测技术在HPV感染基因分型中的应用具有高度特异性、敏感性，可为临床HPV感染诊断和宫颈癌的监测及预防提供可靠的实验依据。

PCR+膜杂交法CT/UU/NG三联检测在临床性病筛查中的应用及与实时荧光PCR法的比较研究

目的:探讨PCR+膜杂交法CT/UU/NG三联检测在临床性病筛查中的应用价值。方法:分别采用PCR+膜杂交法和实时荧光PCR法检测CT、UU、NG,并分析比较两种方法的一致性以及相关性。结果:PCR反向膜杂交法和实时荧光PCR法的CT、UU、NG的筛查结果接近(P>0.05),而男女筛查结果差异较大(P<0.05)。结论:PCR反向膜杂交法操作简便,筛查快速、准确,有与实时荧光PCR法相当的检测准确性,具有较高的临床应用价值,值得在临床中推广应用。

PCR结合反向膜杂交快速鉴定临床常见念珠菌方法学的建立

目的建立PCR结合反向膜杂交技术快速检测临床常见致病念珠菌的方法。方法根据真菌rDNA高度可变区设计白色念珠菌、热带念珠菌,近平滑念珠菌,都柏林念珠菌,光滑念珠菌、克柔念珠菌的种特异性探针,加尾后固定在尼龙膜上,生物素标记的通用引物扩增转录间隔区ITS1,利用反向膜杂交技术快速检测念珠菌种群。结果以上六种念珠菌均能扩增出大小为218 bp的条带,每张膜上只有与靶序列对应的探针点有阳性结果,其他探针点均为阴性。正常人类基因组DNA及临床常见的几种细菌DNA扩增结果均为阴性。结论 PCR结合反向膜杂交技术方法学的建立,可以快速检测临床常见致病的念珠菌。该方法特异性高,耗费时间短。可以快速、准确的为临床抗真菌药物的使用提供指导依据。

PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值

目的:探讨PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值。方法:对1486例疑为泌尿生殖道感染患者分别采用PCR反向膜杂交法及荧光定量PCR(FQ-PCR)检测,并将检测结果与培养结果比较。结果:FQ-PCR检测CT、UU、NG阳性率高于培养法,比较差异有统计学意义(P<0.01);PCR反向膜杂交法与培养法及FQ-PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义;PCR反向膜杂交法、FQ-PCR检测敏感性比较差异无统计学意义,但PCR反向膜杂交法检测特异性高于FQ-PCR,比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:PCR反向膜杂交法筛查CT、UU、NG准确,快速,且筛查特异性高于FQ-PCR,值得临床推广适用。

应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇基因型的研究

应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对乙胺丁醇 (EMB)耐药性。设计与合成用于检测结核分支杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针 ,点于硝酸纤维素膜上 ,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应 (PCR)产物进行反向斑点杂交 ,并与PCR 单链构象多态性 (PCR SSCP)和PCR 直接测序 (PCR DS)结果比较。对 81株结核分支杆菌临床分离株进行分析 ,31株EMB敏感株中 ,2 6株embB基因的SSCP图谱、膜反向斑点杂交结果与标准株 (H37Rv)完全相同 ;其余 5株SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 3株E1b杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→GTG突变 ;2株E1d杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→ATA突变。 5 0株耐EMB菌株中 ,2 4株PCR SSCP图谱与标准菌株相同 ,E1杂交阳性 ;2 6株PCR SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 18株E1b杂交阳性 ,2株E1c杂交阳性 ,5株E1d杂交阳性 ,1株E1e杂交阳性 ,未发现E1f杂交阳性 ,与PCR SSCP、PCR DS分析结果一致。突变检出率为 5 2 %。膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇(EMB)耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交,并与PCR-直接测序(PCR-DS)结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中,14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同;13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变,均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变,该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。

多重荧光PCR分管技术与膜杂交技术在HPV筛查中的对比研究

目的应用多重荧光PCR分管技术及膜杂交技术分别对100例疑似宫颈癌的门诊患者的子宫颈鳞柱状交界处上皮细胞样本进行HPV筛查,并对两种技术及结果进行比对研究。方法应用多重荧光PCR分管技术对临床表现疑似宫颈癌的100例患者进行21种基因型的筛查及病毒载量的标准化定量,应用膜杂交法对100例患者进行21种基因型的筛查(两种技术分别筛查的21种基因型中有17种是相同的,4种是不同的),并以测序技术作为金标准,对上述两种技术的结果进行比对验证,并对两种技术的灵敏度、特异性等诊断效能指标进行对比。结果通过多重荧光PCR分管技术检测出阳性病例为22例,传统膜杂交法检测出阳性病例为13例,有差异性结果的10例患者样本经测序验证,均证实为感染了HPV病毒。利用SPSS软件对二者进行灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值的分析,数据分析证实两种技术方法差异具有统计学意义(P<0.05)。结论通过对比,发现多重荧光PCR分管技术在HPV筛查中有着更高的灵敏度、阳性检测率及阴性预测值,这更能够有效避免阳性病例的漏检,提高宫颈HPV感染的筛查水平,进而提高我国妇女宫颈癌的检出率。

应用聚合酶链反应-反相膜杂交技术检测结核分枝杆菌

目的 探讨聚合酶链反应（PCR）－反相膜杂交技术检测结核分枝杆菌的价值。 方法 收集52例活动性肺结核病人和12例非结核病人的痰标本，以双盲法进行痰涂片抗酸染色检查、结核菌培养、PCR－反相膜杂交技术，PCR－琼脂糖凝胶电泳技术检查对比。 结果 涂片法、培养法，PCR－反相膜杂交法的敏感性分别为28．8％、42．3％、82．7％，PCR－反相膜杂交法的敏感性显著高于培养法和涂片法（P＜0．01）。PCR－反相膜杂交法和PCR琼脂糖凝胶电泳法的敏感性分别为82．7％和84．6％，特异性分别为91．7％和83．3％，前者特异性与后者相比差异有显著性（P＜0．01）。 结论 PCR－反相膜杂交技术可应用于临床检测结核分枝杆菌。

反向膜杂交技术快速检测质粒介导喹诺酮耐药基因qnr方法的建立

目的结合PCR与反向膜杂交技术，探讨建立快速筛查细菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr的方法。方法将qnr各亚型的特异性探针加尾后固定于尼龙膜上，用标记生物素的各亚型引物分别扩增经提取的细菌DNA，与固定在膜上的探针杂交。结果25株qnr阳性菌株中，有6株qnrA阳性菌株，9株qnrB阳性菌株，10株qnrS阳性菌株。所有阳性菌株均能通过反向膜杂交检测到相应的qnr基因的亚型，且可以在同一张膜上进行检测。结论该方法能够快速、准确地检测出临床病原微生物中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr，这对于指导临床及时合理用药，采取措施防止耐药菌的传播均有重要意义。

PCR反向膜杂交技术检测临床标本中结核分枝杆菌

目的 探讨结核分枝杆菌 (TB)PCR反向膜杂交技术的临床应用价值。方法 采用该技术对本院 30 0例确诊结核的或高度怀疑为结核分枝杆菌感染的病人标本、6 0例非结核住院病人标本进行检测 ,同时用培养镜检法、常规PCR法作对照试验。结果 PCR反向膜杂交法检出TB菌 176例、阳性率 (5 8.7% ) ,比培养镜检法 47例 (15 .7% )、常规PCR法 15 6例 (5 2 .0 % )检出率高 ,而对 6 0例证实无结核分枝杆菌的标本、几种方法检测均为阴性。结论 该技术能快速。

反向膜杂交技术检测结核分枝杆菌耐药株的临床价值研究

目的评价反向膜杂交技术对于肺结核病患者的结核分枝杆菌耐药基因检测的临床应用价值。方法利用反向膜杂交技术检测了40株耐药结核分枝杆菌培养分离株、10株非结核分枝杆菌培养分离株、240例肺结核患者痰标本的rpoB、katG,、inhA突变基因。240例痰标本同时进行结核菌培养。106株膜芯片检测阳性样本测序验证。结果特异性方面:膜芯片检测40株结核分枝杆菌培养分离株,均为阳性;10株非结核分枝杆菌培养分离株,均为阴性。灵敏度方面:膜芯片检测240例临床痰标本中,66例结核分枝杆菌阳性,占27.5%。耐药基因准确性方面:106例膜芯片检测阳性的样本进行测序验证,两者结果完全一致。结论反向膜杂交技术可快速检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药突变基因,与常规结核分枝杆菌培养、测序检测耐药基因的结果相符,可应用于临床。

PCR结合反相膜杂交在淋病诊断中的应用

目的 探讨PCR结合反相膜杂交用于临床诊断淋病的可行性。方法 以培养法为金标准 ,对PCR电泳法和PCR反相膜杂交法进行了比较研究。结果 PCR反相膜杂交特异性高 ,灵敏度是PCR电泳法的 40倍。结论 PCR反相膜杂交技术不仅可以提高PCR特异性、敏感性 ,且操作简单 ,无污染 。

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

目的探讨膜-反向斑点杂交技术(RDB)在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象,分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR(RT-PCR)、抗酸染色三种方法检测结核杆菌,对三种方法进行方法学评价。结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为:抗酸染色为32.8%,RT-PCR阳性率为82.8%,RDB阳性率为89.9%,两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05),对照组三种方法检测结果均为阴性;三种结核杆菌的检测方法的方法学评价,RDB灵敏度(90.6%)、约登指数(0.91)、符合率(93.9%)、阴性预测值(85.0%)均较好。结论膜-反向斑点杂交技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上有很高的临床应用价值,值得临床推广应用。

聚合酶链反应反向膜杂交技术检测临床标本中结核分支杆菌的临床意义

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）反向膜杂交技术捡测临床标本中结核分支杆酋（ＴＢ）ＤＮＡ的价值。方法用ＰＣＲ反向膜杂交技术检测 ５２２例结核及６０例非结核患者临床标本中的ＴＢ－ＤＮＡ，同时用培养、抗酸染色涂片及常规ＰＣＲ法作对照。结果ＰＣＲ反向膜杂交法阳性率为８０．６％（４１１／６９０），培养为１８．１（１２５／６９０），镜检为１３．９％（９６／６９０），常规ＰＣＲ为５９．６％（４１１／６９０），ＰＣＲ反向膜杂交法与常规法比较（Ｐ＜０．０００１），差异有显著意义。ＰＣＲ反向膜杂交法阳性检出率高于常规ＰＣＲ（Ｐ＞０．０５），但差异无显著意义；该技术假阳性为零。结论ＰＣＲ反向膜杂交技术检测临床标本中ＴＢ－ＤＮＡ具有快速、高度特异性和敏感性，可为结核病的临床早期诊断提供一种新的病原学诊断手段。

PCR反向膜杂交技术检测乙型肝炎病毒

目的探讨PCR反向膜杂交技术在乙型肝炎病毒 (HBVDNA)检测中的应用。方法用PCR反向膜杂交技术定性检测 10 0例血清标本中的HBVDNA ,结果与常规PCR法和酶联免疫吸附测定 (ELISA)方法比较。结果 10 0例血清标本 ,本法阳性率为 5 3 0 % ,常规PCR法为 47 0 %。HBsAg(+)和HBeAg(+)与HBVDNA有很好的相关性。结论该技术能快速、敏感和高度特异地对PCR产物进行鉴定 ,亦可检测HBV的真实感染和复制情况 ,有助于乙型肝炎的临床诊断。

鲁梅克斯K—1杂交酸膜及其丰产栽培技术

梅克斯K—1杂交酸膜是由新疆鲁梅克斯绿色产业有限公司与新疆农业大学在引进酸膜K—1的基础上选育成功的。

PCR反向膜杂交技术检测临床标本中结核分支杆菌的临床意义

目的 探讨聚合酶链反应 (PCR)反向膜杂交技术检测临床标本中结核分支杆菌 (TB)DNA的价值。方法 用PCR反向膜杂交技术检测 5 2 2例结核及 6 0例非结核患者临床标本中的TB DNA ,同时用培养、抗酸染色涂片及常规PCR法作对照。结果 PCR反向膜杂交法阳性率为 80 .6 % (5 5 6 /6 90 ) ,培养为 18.1% (12 5 /6 90 ) ,镜检为13.9% (96 /6 90 ) ,常规PCR为 5 9.6 % (411/6 90 ) ,PCR反向膜杂交法与常规法比较 (P <0 .0 0 1) ,差异具显著意义。PCR反向膜杂交法阳性检出率高于常规PCR ,差异具显著意义 (P <0 .0 0 1) ;该技术假阳性为零。结论 PCR反向膜杂交技术检测临床标本中TB DNA具有快速、高度特异性和敏感性 ,可为结核病的临床早期诊断提供一种新的病原学诊断手段。