酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白

背景与目的:乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)X蛋白是一个广义反式作用因子,同原发性肝癌的发生发展密切相关,由于其功能同蛋白-蛋白间相互作用有关,故本研究利用酵母双杂合体系筛选并鉴定HBVX蛋白结合蛋白。方法:聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)法扩增HBVX基因序列,酵母双杂合体系3构建饵质粒pAS2-1-X,进行序列测定后转化入酵母菌AH109,以Westernblot法验证X-BD融合蛋白在酵母细胞中的正确表达。pAS2-1-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养、β-半乳糖苷酶活性测定筛选阳性菌落,分离实验及交合实验排除假阳性,扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定,检索其同源序列。结果:成功构建了pAS2-1-X饵质粒,Westernblot证实转化的酵母细胞能正确表达X-BD融合蛋白,pAS2-1-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养共长出97个菌落,β-半乳糖苷酶活性测定、分离实验及交合实验后筛选出1个阳性克隆,其cDNA插入片段与Fis基因高度同源。结论:通过酵母双杂合体系筛选出一个在酵母细胞内能与X蛋白结合的Fis蛋白。

酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S_1相关蛋白的研究

目的 利用酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前 S1 (pre S1 )蛋白相关蛋白 ,以利于探讨前 S1 蛋白在乙型肝炎病毒的入胞机制。 方法 以 HBV DNA阳性血清为模板通过PCR法扩增含 Eco R 与 Pst 酶切位点的 pre S1 基因序列 ,p AS2 - 1载体及 pre S1 基因 PCR产物经双酶切并连接 ,转化到大肠杆菌 JM10 5 ,对重组质粒 p AS2 - 1- pre S1 进行序列测定。乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌 AH 10 9,以Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。将p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞 ,通过选择性培养、L ac Z活性测定筛选阳性菌落 ,分离实验及交合实验排除假阳性 ,PCR扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定 ,结果提交 NCBI的 BL AST应用程序 ,在Gene Bank 数据库查询其同源序列。 结果 重组质粒p AS2 - 1- pre S1 经序列测定含有完整的 pre S1 基因片段 ,Western Blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的pre S1 - BD蛋白 ,p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞后 ,在 5× 10 6 转化子中 ,经选择性培养共长出 97个菌落 ,17个为 L ac Z阳性菌落 ,分离实验及交合试验筛选出 1个阳性菌落 ,PCR扩增产物经 Gen Bank数据库查询与人类初期多肽相关复合体

杂合新闻体系中媒介公共性的重构

杂合新闻体系的成型,一方面给传统新闻媒介带来了公共性流失的危机,另一方面为传统新闻媒介带来了重构公共性的有利条件。新闻媒介需要站在“共识结构”这一更高的维度上重构公共性,需要通过重塑杂合新闻体系行动者网络的方式来贡献于共识结构。

杂合化新闻:理念演进与全球实践

新闻从专业系统走向杂合化生产,在杂合化媒介系统中具有了前所未有的延展性和不确定性。本文以美西方为代表的“全球北方”国家新闻业的历史进程为主要参照,兼顾“全球南方”的本土化创新探索,厘清杂合化新闻演进的历史脉络、概念要义及其在全球社交媒体平台的实践应用。以“信息娱乐”为主要特征的新闻场域与其他场域的联结,成为杂合化新闻发展的重要历史事件。其核心特征具体表现为延伸与赋能、协作与策展、融合与杂糅等三个方面。

信用风险分析方法的发展

对目前极具应用前景的信用风险分析方法进行了评述,分析了它们的特点、应用及进展,并在此基础上,提出了我国相应的决策,以便为促进我国信用风险管理水平的提高提供有益的借鉴。

乙型肝炎病毒前S1结合蛋白的筛选和鉴定

目的利用酵母双杂合体系筛选HBV前S1结合蛋白，进一步探讨前S1蛋白在HBV感染中的作用。方法PCR扩增HBV前S1基因序列，根据酵母双杂合体系构建饵质粒pAS2-1-preS1，并测定序列；饵质粒转化入酵母菌AH109，Western印迹法证实前S1-BD融合蛋白在酵母细胞中的正确表达。pAS2—1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞，通过选择性培养及β-半乳糖苷酶活性测定筛选阳性菌落，分离实验排除假阳性克隆，扩增阳性克隆的目的基因并测定序列，查询其同源序列，行交合实验进一步证实目的蛋白同前S1蛋白在酵母细胞中能否特异性结合。结果成功构建pAS2-1-preS1饵质粒，Western印迹法证实转化饵质粒的酵母细胞能正确表达前S1-BD融合蛋白，pAS2—1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后，选择性培养出101个菌落，经β-半乳糖苷酶活性测定及分离实验后筛选出1个阳性克隆，其cDNA插入片段与丝裂原活化蛋白激酶-胞外信号调节蛋白激酶（MAPK—ERK）激酶1（MEK1）基因高度同源。交合实验证实MEK1同前S1蛋白在酵母细胞中可特异性结合。结论酵母双杂合体系证实MEK1可能是一个前S1结合蛋白。

c-Mpl信号转导相关蛋白的结合域确定

血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是调节血小板生成最主要的细胞因子,它的生物学效应由其受体c Mpl介导.为了确定SGK,14 3 3,Siva,Tom1,Cop9 S3和c MplBP等6种蛋白在c Mpl上的结合区域,构建c Mpl膜内部分系列缺失片段及点突变,用酵母双杂合的方法检测这些片段与上述6种蛋白的结合情况,发现Box1是c Mpl与这6种蛋白结合的主要区域.Box1两侧的序列及C端区域对c Mpl与这6种蛋白的结合也有帮助.将c Mpl膜内部分的第531位Ser(位于Box1内)突变为Ala和Val后,c Mpl与SGK,14 3 3,Tom1和Cop9 S3的结合能力明显下降,提示Ser531可能对c Mpl与这4种蛋白的结合起重要作用.