连续3步缺口修复技术构建牛αS1酪蛋白-人溶菌酶杂合基因座

目的:构建一个牛αS1酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列的杂合基因座。方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术。将6个无痕连接的同源臂插入以pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基因抓捕的载体,利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛αS1酪蛋白3'端调控序列(9 kb)、hLYZ基因座序列(5 kb)、牛αS1酪蛋白5'端调控序列(20 kb),使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成牛αS1酪蛋白-hLYZ杂合基因座。结果:实验经过PCR扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了hLYZ的基因组序列对牛αS1酪蛋白编码基因组序列的精确置换。结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法。

连续3步基因抓捕构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座

目的:构建一个利用牛αS1酪蛋白基因座完整的上下游调控序列指导人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因组序列在乳腺特异性高效表达的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。方法:采用连续3步基因抓捕的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行3次基因抓捕的抓捕载体;然后,在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,第一步从含牛αS1酪蛋白基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆9 kb的牛αS1酪蛋白基因3'端侧翼序列到抓捕载体上,第二步从人tPA BAC上亚克隆17 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的人tPA基因组序列,第三步从牛αS1酪蛋白BAC上亚克隆20 kb的牛αS1酪蛋白基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个长约46kb的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座中,原牛αS1酪蛋白基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换。结论:连续三步基因抓捕构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了探索性研究。

连续3次基因抓捕构建人EEF1A1-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的利用人类真核翻译延伸因子1A1(Human eukaryotic translation elongation factor 1A1,hEEF1A1)基因座完整的上下游调控序列和人凝血因子Ⅶ(Human coagulation factorⅦ,hFⅦ)基因组序列构建hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。方法首先构建连入6个同源臂的pBR322作为连续3次基因抓捕的载体;然后通过Red同源重组系统,在大肠杆菌内进行缺口修复。第一步将hEEF1A1基因3′端侧翼序列亚克隆至抓捕载体上,第二步将hFⅦ完整基因组序列亚克隆至抓捕载体上,第三步将hEEF1A1基因5′端完整侧翼序列亚克隆至抓捕载体上。结果经3次基因抓捕,3个基因片段在抓捕载体上无痕连接,形成一条长约50 000 bp的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。经PCR、酶切及测序验证,构建的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座中,原hEEF1A1基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ基因组序列精确置换。结论成功构建了hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座,为哺乳动物细胞表达大载体的制备提供了实验依据。

应用荧光复合扩增技术对河南汉族群体9个STR基因座的多态性研究

目的：调查何南汉族群体的Ｄ３Ｓ１３５８、ｖＷＡ、ＦＧＡ、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０等９个ＳＴＲ基因座的基因频率分布，获得群体遗传学数据，研究其法医学应用。方法：用ＰＣＲ复合扩增和四色荧光自动化检测技术分析９个ＳＴＲ位点的基因型，计算各等位基因的分布频率。结果：获得９个ＳＴＲ位点在河南汉族群体中的等位基因分布频率资料，共检出９８个等位基因；家系调查，证明上述位点遗传稳定，符合孟德尔遗传规律。９个ＳＴＲ基因座总鉴别机率（ＴＤＰ）达９９．９９９９９９６％。结论：上述９个位点是较理想的遗传标记，可用于法庭科学实践中生物物证的个人识别及亲子鉴定。

DNATyper^(TM)15与Identifiler^(TM)试剂盒对陈旧骨骼、牙齿和指甲样本检验结果的比较分析

目的通过国产DNATyperTM15和进口IdentifilerTM试剂盒对陈旧骨骼、牙齿和指甲样本的检验结果比对分析,了解国产试剂盒对降解检材的检验效果,探讨在案件检验中应用的可行性。方法提取陈旧骨骼、牙齿和指甲样本的DNA后,用DNATyperTM15及IdentifilerTM试剂盒同步扩增,并用检出率、杂合子基因座上等位基因均衡性(PHR)和等位基因分型结果一致性,对DNATyperTM15和IdentifilerTM试剂盒进行比较。结果 45例陈旧骨骼、牙齿和指甲样本,DNATyperTM15试剂盒成功检出399例,检出率88.7%,IdentifilerTM试剂盒成功检出404例,检出率89.8%;DNATyperTM15试剂盒和IdentifilerTM试剂盒共同检出398例,在这398例样本中,PHR≤0.5分别为128个和117个;同一样本中,相同基因座上两种试剂盒检出的等位基因分型结果完全一致。经统计学分析,两种试剂盒的检出率和杂合子基因座上等位基因均衡性的检测结果均无统计学差异(P>0.05)。结论国产DNATyperTM15试剂盒可有效应用于实际案件中陈旧骨骼、牙齿及指甲样本的检验。