杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达

根据抗菌肽天蚕素A（cecropinA，CA）N端第1-7个氨基酸残基，马盖宁（magainin，M）N端第2—12个氨基酸残基，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA（1—7）-M（2—12）基因，同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168，在醇氧化酶（AOX）启动子调控下，分子量约1．9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达，抗菌特性研究表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，对多数G菌及G^＋菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定，显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3．2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

杂合抗菌肽CecA_mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

参照毕赤氏巴斯德酵母 (Pichiapastoris)偏好密码子 ,改造并化学合成杂合抗菌肽CecA_mil基因 ,改造后的CecA_mil基因克隆到pPICZα_A载体中 ,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα_A_CM ,转化Pichiapastoris受体菌X_33。在醇氧化酶 (AOX)启动子调控下 ,分子量约 1 9kD的CecA_mil杂合抗菌肽获得表达 ,经表达条件优化 ,重组酵母菌的摇瓶发酵产率可达到 2 4 5 μg mL。抗菌特性研究表明 ,该表达产物具有广谱抗菌活性 ,对多数G- 菌及G+ 菌均有较好的抑菌活性 ,特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性菌抑杀效果更好 ;具有热稳定性和酸稳定性。这些特点使得重组抗菌肽CecA_mil在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

天蚕抗菌肽A与蜂毒素杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的克隆与表达

根据天蚕抗菌肽A(cecropinA ,CA)N端第 1～ 7个氨基酸残基、蜂毒素 (melittin ,M )N端第 5～ 12个氨基酸残基 ,以大肠杆菌偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1～ 7) -M(5～ 12 )基因 ,同载体 pGEMEX - 1连接后转化大肠杆菌JM 10 9,经打点杂交筛选和序列测定 ,获得一个与设计一致的克隆。将此克隆中的质粒亚克隆至JM10 3(DE3) ,经IPTG诱导、BrCN切割和抑菌圈试验表明 ,克隆的杂合肽基因在JM 10 9(DE3)中获得了表达。

两种杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及活性测定

参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)的偏好密码子,改造克隆杂合抗菌肽CA(1～7)M(4～11)和CB(1～7)M(4～11)基因,将改造后的基因克隆到pPICZ-αA载体中,构建分泌型表达载体pPICZ-αA-CAM和pPICZ-αA-CBM,转化宿主菌Pichia pastorisX-33,在甲醇的诱导下进行表达.实验结果表明,杂合抗菌肽获得表达,两种表达产物具有明显的抗菌活性.此外,本文还比较了二者的抗菌谱,分析了杂合肽的性质,优化了酵母电转化条件.

家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

A 44-residue hybrid peptide (CB (1-24)-Arg-Ser-Tyr-Tan (4-21)) incorporating 1-24 residues of cecropin B (CB) and 4-21 residues of thanatin (Tan) was designed and constructed. The CB-Tan gene was cloned into expression plasmid pGEX-3X and expressed in E.coli BL21. The fusion protein was purified by affinity chromatography. After digested with enterokinase the gene product released with antibacterial activity and gave one band in Tricine-SDS-PAGE.

牛乳铁蛋白素-马盖宁杂合抗菌肽的设计、合成及抑菌活性

根据抗菌肽牛乳铁蛋白素(Lfcin B)与马盖宁(Magainin)的核心功能序列,将Lfcin B(1-15)和Magainin(1-12)二者连接起来,设计一种新型杂合抗菌肽LFB15-MA12,采用固相化学合成法合成获得纯度大于95%的LFB15-MA12。微量肉汤稀释法测得LFB15-MA12对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、绿脓杆菌ATCC27853、鼠伤寒沙门氏菌C77-31四种细菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibition concentration,MIC)分别为16、64、64和32μg·mL-1,在抑菌浓度范围内未表现出溶血活性。获得了一种具有较高抗菌活性且安全无毒的新型抗菌肽,为研究开发理想的新型抗菌肽分子提供了新思路。

Attacin-Thanatin杂合抗菌肽的融合表达及其菌内抑菌活性

构建杂合抗菌肽Attacin-Thanatin(简称mAT)融合表达重组菌株,对其在大肠杆菌系统中的表达特性及其融合表达产物的菌内抑菌活性进行了研究。将mAT重组表达质粒pET-mAT(pe)依次转化宿主菌E.coliDH5α、BL21(DE3)、Rosetta-gamiTM(DE3)pLysS,采用IPTG诱导表达;优化筛选该抗菌肽的敏感菌株、IPTG浓度、宿主菌诱导起始浓度等,初步建立了抗菌肽菌内抑菌活性检测方法,用于研究该杂合抗菌肽的体内抑菌活性。SDS-PAGE分析结果显示,宿主菌Rosetta-gamiTM(DE3)pLysS可获得表达的融合产物,而E.coliDH5α、BL21(DE3)经IPTG诱导后未检测到目的条带;优化结果显示,以E.coliDH5α宿主菌、IPTG工作浓度0.1 mmol/L、起始诱导菌浓度D600 nm值0.3为检测抗菌肽菌内抑菌活性的最佳条件;mAT融合表达产物抑菌活性的检测结果显示,宿主菌被本身所表达的杂合抗菌肽融合蛋白所抑制,增殖速度放缓。利用Rosetta-gamiTM(DE3)pLysS有效融合表达mAT并初步建立的抗菌肽菌内抑菌活性快速检测方法为进一步研究mAT奠定了基础。

杂合抗菌肽Scy-Hep3在毕赤酵母中的分泌表达及其抗菌活性

为获得体外稳定表达的高抗菌活性新型抗菌肽,通过重叠延伸PCR技术获得了拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin (简记为Scy)和斜带石斑鱼抗菌肽Hepcidin 3 (简记为Hep3)的杂合抗菌肽基因scygonadinhepcidin3 (简记为scy-hep3),将scy-hep3与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-scy-hep3,用电转化法将其转化至毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽Scy-Hep3,并进行抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-scy-hep3,用体积分数为0. 5%的甲醇诱导表达24 h,分泌表达上清液中获得了稳定表达的相对分子质量约24 000的表达产物,与预期杂合抗菌肽Scy-Hep3的大小相符;抗菌活性结果表明,杂合抗菌肽Scy-Hep3具有广谱抗菌活性,对被测的3种革兰氏阳性菌(溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus、谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和4种革兰氏阴性菌(施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和弗氏志贺氏菌Shigella flexneri)具有较强的抗菌活性(最小抑菌浓度MIC<12μmol/L);对比于单一的抗菌肽Scy和Hep3,杂合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性显著增强。本研究结果将为杂合抗菌肽Scy-Hep3的生产和开发应用提供数据资料。

抗菌抗病毒杂合肽C-L的抑菌谱及在模拟胃肠液中稳定性的研究

为分析实验室前期筛选获得的高效抗菌抗病毒杂合肽CecropinA(1-8)-LL37(17-30)(简称C-L)的抑菌谱及在模拟胃肠液中的稳定性,首先利用牛津杯琼脂扩散法,检测其对9种指示菌的抑制效果;然后通过模拟胃肠液处理,观察其抑菌活性变化。结果表明:抗菌抗病毒杂合肽C-L对多种致病菌(金黄色葡萄球菌ATCC43300、金黄色葡萄球菌CVCC1882、金黄色葡萄球菌耐药菌100621、李斯特菌CVCC1599、沙门氏菌CVCC2212、大肠杆菌245)均具有良好的抑制效果,并对益生地衣芽孢杆菌CGMCC1.807无明显的抑菌作用,且抗菌肽C-L经过模拟胃肠液处理后依然保持约90%的抑菌活性。由此表明,该抗菌肽具有良好的抑菌特性及抵抗模拟胃肠液消化的稳定性,对设计优良特性的抗菌肽具有重要的启示,并在健康养殖中具有广阔的应用潜力和价值。

新型抗肿瘤杂合抗菌肽的设计、合成及抗肿瘤活性研究

目的探讨新型抗肿瘤杂合抗菌肽的设计、合成及抗肿瘤活性。方法利用抗菌肽数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)进行抗肿瘤抗菌肽的数据参数分析,筛选出与人类密切相关的抗肿瘤抗菌肽即人中性粒细胞防御素-1(HNP-1)、LL-37和Maximin 1、Dermaseptin-B2,经Genbank、DNASTAR、Prot Param、Antheprot生物信息学软件分析序列,截取其活性片段,把其中色氨酸(Trp,W)替换为亮氨酸(Leu,L)、增加两个甘氨酸(Gly,G),其主要目的是增加其净电荷数和亲水性,合成新型杂合肽;采用实时阻抗细胞分析技术(RTCA)和噻唑蓝(MTT)法测试合成的新型杂合肽对肿瘤细胞活力及毒性作用。结果经生物信息学软件分析所得5条杂合肽均属于稳定的阳离子抗菌肽,且具有较好的物理活性;同时杂合肽使肿瘤细胞活力降低并表现出抑制活性。结论成功设计合成了5条具有抗肿瘤活性的新型杂合抗菌肽。

杂合抗菌肽基因的设计及表达载体的构建

为高效表达具有高抗菌活性的抗菌肽,根据Magainin 2(MA)、Sapecin(SA)和Melittin(ME)基因核心序列,设计杂合抗菌肽MA-SA-ME(MSM)基因并进行密码子优化。生物信息学分析显示,该抗菌肽具有很好的抗菌作用。将MSM基因与毕赤酵母表达载体pPICZα-A连接,构建重组表达载体pPICZ-αA-MSM,以实现抗菌肽基因MSM在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。构建的重组表达质粒经PCR检测、双酶切和测序3步鉴定表明,构建的重组表达质粒与预期完全相符,可用于下一步的毕赤酵母表达试验。

杂合抗菌肽Sα-Jp基因真核表达载体的构建

为获取高效表达且具有抗菌活性的新型杂合抗菌抗菌肽。根据Spinigerinα、Japonicin II抗菌肽的氨基酸序列,结合蛋白质分子的结构和抗菌肽的抑菌机制,选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成杂合抗菌肽Sα-Jp基因,并将其定向克隆至真核表达载体pPICZαA上。经聚合酶链式反应,双酶切,序列分析等鉴定,所转化的宿主菌中含有插入Sα-Jp基因的重组表达载体pPICZαA-Sα-Jp。结果表明:已成功构建真核表达载体,可用于真核分泌表达。

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体p PICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为:28℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S.aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为10μg/m L。

杂合抗菌肽MgJ基因真核表达载体的构建

根据Magainin-Ⅱ和Japonicin-Ⅱ的基因序列,用一个铰链结构ser-ser-gly-ser-gly-ser相连,结合巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子设计出杂合抗菌肽基因MgJ。通过重叠聚合酶链反应(overlapping PCR)法合成基因片段,再将基因按正确的阅读框架定向克隆至巴斯德毕赤酵母的高效表达载体pPICZαA上。经酶切鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5α菌落中含有插入MgJ基因的重组质粒pPICZαA-MgJ,结果表明,成功构建了杂合抗菌肽MgJ基因真核表达载体pPICZαA-MgJ。

杂合抗菌肽MgJ抗菌活性的初步研究

采用琼脂孔穴扩散法和微量稀释法,对人工合成的杂合抗菌肽抗菌肽MgJ的抗菌活性进行研究,结果表明,抗菌肽MgJ具有较强的抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的活性,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为10μg/ml,对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为5μg/ml.

杂合抗菌肽Py-Sα真核表达载体的构建

本文根据抗菌肽Polyphemusin I和Spinigerinα的氨基酸序列,结合Pichia pastoris;偏爱密码子,人工设计合成杂合抗菌肽Py-Sα基因。按照正确的阅读框架将其定向克隆至真核表达载体p PICZαA上。经PCR及双酶切鉴定,所转化的宿主细胞中含有插入Py-Sα的重组质粒p PICZαA-Py-Sα,结果成功构建了杂合抗菌肽Py-Sα的真核表达载体。

天蚕素A-马盖宁杂合肽体外抗白色念珠菌活性实验研究

目的:本实验旨在研究天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌的体外抗菌活性。方法:选取10株临床分离的白色念珠菌和其标准菌株,采用K-B法和肉汤稀释法测定天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌的抑菌效果和最小抑菌浓度。结果:天蚕素A-马盖宁杂合肽对11株白色念珠菌均有抑菌作用,且最小抑菌浓度测定为0.16 mg/m L。结论:天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌具有一定的抑菌作用。

天蚕素A-蛙皮素杂合肽突变体的构建、表达及其抗菌活性

目的构建天蚕素A(1～8)-蛙皮素(1～12)杂合基因抗菌肽(CA-MA杂合肽)突变体,在大肠杆菌中融合表达,并进行抗菌活性检测。方法采用PCR体外定点突变技术,设计1对方向相反的引物,其中1个引物引入突变点,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行重组表达质粒pGEX-4T-1-CA-MA的PCR扩增,使CA-MA杂合肽第16位密码子由AGT突变为TGG。将扩增片段自身连接,构建CA-MA杂合肽突变重组表达质粒pGEX-4T-1-W16-CA-MA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达突变体蛋白W16-CA-MA,并对表达产物进行纯化。分离GST融合蛋白后,进行抗菌活性检测。结果重组突变表达质粒DNA测序结果表明,在预期位点发生了突变;突变蛋白在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的18%;纯化后蛋白纯度可达75%以上,并具有一定的抗菌活性。结论已成功获得了具有抗菌活性的杂合肽突变体W16-CA-MA。

杂合抗菌肽Me-HNP1真核表达载体的构建与初步表达

选择蜂毒肽(Melittin)和人体防御素(HNP-1)部分基因序列进行人工融合,通过生物信息学技术预测其理化性质和功能结构,依据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1基因,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增目的基因并定向克隆至穿梭型表达载体pPICZa A上,将构建成功的分泌表达载体pPICZαA-Me-HNP1通过电转化的方式转化到毕赤酵母感受态细胞GS115内,以甲醇为诱导剂进行诱导表达,将得到的粗蛋白进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳在5 kDa处得到一条单一清晰条带,表明杂合抗菌肽Me-HNP1在毕赤酵母中成功表达,生物信息学分析得出杂合抗菌肽Me-HNP1分子内带有8个正电荷,等电点为9.55,脂溶性80.44,在酵母体内半衰期大于20 h。表明其具有成为优秀抗菌肽潜力。为抗菌肽的研究奠定了实验基础。

利用重叠PCR技术合成杂合抗菌肽基因CB-Tmp1

以Cecropin B与Tmp1为母本,设计了两条杂合抗菌肽。由于直接合成基因全序列费用比较高,为降低实验成本,实验采用重叠PCR法。将两条杂合抗菌肽基因序列总共分成7个部分,设计了6条重叠引物,利用重叠PCR法成功合成抗菌肽基因全序列,并构建了重组质粒pMD18-T1和pMD18-T2。经过测序验证,利用重叠PCR的方法扩增出来的基因序列与设计的序列完全相符。