多主棒孢CcCas2基因纯合敲除突变体构建及致病功能

多主棒孢引起的棒孢叶斑病为我国黄瓜生产上重要的新兴流行病害。多主棒孢寄主广泛,其cassiicolin(Cas)毒素是多主棒孢侵染橡胶早期的关键致病因子,但在黄瓜/多主棒孢病害系统中的毒力功能目前尚不明确。本研究从来自黄瓜多主棒孢HG3菌株的基因组序列中鉴定到单拷贝的Cas2亚型基因,命名为CcCas2。在敲除该基因的过程中,发现CcCas2缺失突变体均为杂合,荧光染色试验进一步证实多主棒孢是多核真菌。对杂合突变体进行潮霉素筛选并单孢纯化,获得了纯合的CcCas2缺失突变体菌株(检出率≥20%)。致病力测定显示,CcCas2纯合突变体和野生型菌株接种黄瓜叶片4 d后的发病程度相当。通过转录组数据、RT-PCR和qRT-PCR分析均发现CcCas2在转录水平上受到了强烈地抑制。本研究明确了多主棒孢CcCas2基因由于在转录水平受到抑制而对黄瓜没有毒力;所提出的多主棒孢纯合突变体高效获取方法为该菌进一步的功能基因研究奠定了基础。

fl(2)d单等位基因的敲除显著降低小菜蛾的生殖力和育性

【目的】RNA甲基化是基因转录后水平表观修饰的主要形式,参与了众多重要的细胞学过程。小菜蛾(Plutella xylostella)是危害十字花科蔬菜的重要寡食性害虫,与RNA甲基化相关基因的功能尚未见报道。本研究通过克隆小菜蛾的RNA甲基化蛋白同源基因fl(2)d,鉴定其表达模式,并敲除该基因以探究其生物学功能。【方法】通过小菜蛾基因组网站查找fl(2)d基因序列,PCR扩增其蛋白质编码序列(CDS);采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测小菜蛾不同发育阶段个体以及成虫生殖腺中fl(2)d的相对表达量;运用CRISPR/Cas9结合卵的显微注射技术,对小菜蛾fl(2)d进行编辑;将fl(2)d被编辑过的成虫与野生型成虫杂交,并对其产生的后代进行近交,筛选fl(2)d突变品系;观测并比较突变体与野生型个体遗传特性、生物学参数和表型的差异,明确fl(2)d的功能。【结果】克隆得到长度为912 bp的fl(2)d CDS,fl(2)d在雌蛹、雌成虫和卵中的表达量较高,雄成虫和雄蛹的表达量较低,幼虫期的表达量最低,成虫卵巢中表达量显著高于精巢。通过向小菜蛾的卵注射靶向fl(2)d的向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白的混合物,对所产生的阳性后代进行10代的单对近交筛选,获得3种杂合的移码突变品系,分别缺失了4个(Δfl(2)d213-4)、5个(Δfl(2)d213-5)和7个(Δfl(2)d214-7)碱基。在上述品系的筛选过程中,发现了6只缺失4个碱基的纯合突变个体,2只缺失5个碱基的纯合突变个体;缺失4个碱基的纯合个体成功配成了两对,近交未产卵;剩余的2只缺失4个碱基的雄性纯合个体和2只缺失5个碱基的雄性纯合个体分别与同世代的雌性杂合突变个体近交后仍未产卵。说明fl(2)d纯合突变的个体存活率极低,且可能无法产生后代。通过分析后代基因型的分离比,发现杂合突变个体近交以及杂合突变个体与野生型个体杂交产生的后代中,杂合突变个体与野生型个体的比例分别略小于2和1,说明fl(2)d杂合突变会影响小菜蛾正常的生长发育,并导致部分个体死亡。杂合突变体后代中含有突变的雌雄个体比例接近1﹕1(P<0.05),推测小菜蛾fl(2)d可能与性别决定无关。只要是有突变品系小菜蛾所参与的交配,雌成虫产卵量和卵的孵化率均显著低于野生型(P<0.01),所产的卵多数发育异常,表现为失水皱缩、不能正常孵化。通过对成虫的生殖腺进行解剖,发现在野生型雌成虫与突变体雄成虫交配后,卵巢内卵的附着量较未交配的个体明显减少;未交配的突变体雌成虫卵巢内卵的附着量亦少于野生型,而突变体雄成虫的精巢未见明显异常。部分能够孵化的杂合突变个体在整个发育过程会发生不同程度的畸变,导致不能正常完成整个世代;另外一些杂合突变个体未见异常,可以将突变类型遗传给后代。根据上述发现,提出了基于fl(2)d的小菜蛾遗传防控模型。【结论】fl(2)d参与小菜蛾的生殖过程和胚胎发育,突变后显著影响后代种群数量,是开展小菜蛾遗传控制的理想靶标。