人白介素10重组腺相关病毒血清型2/1杂合载体的构建及转导供肝的效果

目的:构建含人白介素10(hIL-10)的腺相关病毒血清型2/1杂合载体(AAV2/1),并观察其在供肝移植物中的表达.方法:采用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增hIL-10cDNA,将其克隆对pMD18-T载体中,测序后,再经酶切定向插入真核表达载体pSNAV,用脂质体介导转染BHK21细胞,经G418筛选得到含ITR—hIL-10-ITR的BHK21细胞株,用携带rep2-cap1基因的辅助病毒(rHSV/r2c1)感染该细胞株.通过细胞孵育、裂解和病毒纯化,得到含hIL-10的AAV2/1载体.在供肝灌洗、保存中应用该重组病毒载体转染供肝移植物,移植后检测其在移植物中的表达.结果:RT-PCR扩增的hIL-10cDNA序列与GenBank中hIL-10cDNA序列一致,构建了rAAV2/1-hIL-10表达载体.转染供肝移植物后可检测到hIL-10,持续24wk表达.移植后24wk,实验组供肝中hIL-10的表达比空白对照组和rAAV2/1-GFP对照组显著增高(219.15±45.83ng/Lvs40.02,38.64ng/L,P<0.05).结论:成功构建了rAAV2/1-hIL-10表达载体系统,并在大鼠供肝中持续表达hIL-10,为IL-10在器官移植中的生物学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础.

腺病毒-甲病毒杂合载体的构建

目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下:利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子(CD11a promoter,CD11Ap)、甲病毒载体元件(nsP)、目的基因(GFP)、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数(100MOI)分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP+细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP+细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。

双敏感杂合脂质体体外释放度的研究

目的:制备载索拉非尼的核壳结构杂合脂质体(HA-Sf-CL),考察其理化性质和pH/酶敏感性。方法:采用薄膜分散法制备装载Sf的阳离子脂质体内核(Sf-CL),再将阴离子材料外壳透明质酸(HA)静电吸附到内核上,得到杂合脂质体HA-Sf-CL,对其包封率、载药量、粒径、多分散系数、Zeta电位、形态及体外释药特性进行考察。结果:内核包封率86.61%±0.73%,平均载药量为4.98%±0.049%,平均粒径221.7±10.1 nm,PDI为0.182±0.032,Zeta电位为43.8±2.9 mV;最优处方HA-Sf-CL平均粒径236.1±5.8 nm,PDI为0.151±0.020,Zeta电位为-40.9±0.7 mV,外观圆整。HA-Sf-CL再当前条件下稳定性良好,体外释放呈现pH和酶双敏感的特征。结论:成功制备了pH/酶双敏感杂合脂质体,为进一步研究和体内抗肿瘤能力提供基础。

基因治疗的病毒载体系统

病毒载体是基因治疗中应用最为广泛的载体系统。该文就RNA病毒载体、DNA病毒载体和杂合病毒载体的生物学特性、基因组特点以及其在基因治疗中的优缺点进行综述,并对病毒载体系统的发展前景进行了展望。