杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究

杂色云芝发酵液,经超滤、DEAE-Sephadex A250柱层析两步分离、纯化出两型漆酶.以愈创木酚与酶带在适当条件下反应呈棕红色谱带鉴定出漆酶谱带.两型漆酶分别命名为LacA和LacB.经测定两漆酶亚基的分子量分别为66.0kDa和30.7kDa;等电点pI分别为4.79和5.18;LacA的最适作用温度是40℃,LacB为50℃;保温2h, LacA的半失活温度为60℃,LacB为90℃;LacA和LacB催化愈创木酚的酶活最适pH值均为4.0; 二者的稳定pH值也都在2.5～5.5之间.LacA催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为286.5μmol·L-1和292.4nmol·mL-1·min-1;LacB催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为813.0μmol·L-1和127.4nmol·mL-1·min-1.

杂色云芝产木质纤维素酶及对稻草秸秆的降解

在外加碳源和氮源的固态稻草秸秆基质上,对杂色云芝生长过程中产酶活性、主要化学成分及结构进行了分析.结果表明,不同的碳源、氮源浓度对所产酶活性有较大影响,除产半纤维素酶的最佳条件是低碳低氮外(0.15%的葡萄糖和0.03%氯化铵),其他如纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰依赖过氧化物酶和漆酶产生的最佳条件都是高碳低氮(2%的葡萄糖和0.03%氯化铵).各种酶在稻草秸秆的降解中起着关键作用,酶活性直接影响主要化学成分的降解率.纤维素和半纤维素的降解对木质素的降解有明显的促进作用.经过32d的培养,稻草秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为65.39%,45.11%和39.16%.经过降解,秸秆结构发生了明显的变化.

杂色云芝产漆酶的发酵条件研究

本文对杂色云芝（Coriolus versicolor）产漆酶的发酵条件作了研究。结果表明摇瓶实验产漆酶（Laccase）的最佳培养基成分为：可溶性淀粉 2g/L, NH4Cl 24mmol/L, 微量元素混合液 7ml/L, pH3.0柠檬酸—Na2HPO4缓冲溶液 0.01mol/L, KH2PO4 1.4×10-2 mol/L, MgSO4·7H2O 2.03×10-3mol/L, CaCl2·2H2O 6.8×10-4 mol/L, VB1 2.97×10-6 mol/L, 吐温80 4.0g/L, 愈创木酚0.01mmol/L, CuSO4 ·5H2O 0.005mmol/L，最佳发酵条件为培养基初始pH3.0, 菌体生长6d，培养基装量为250ml三角瓶中25ml培养液，25℃条件下振荡培养(150r/min)9d。

杂色云芝组成型漆酶Ⅰ的纯化和底物专一性

采用合成培养基培养杂色云芝As5 4 8,从发酵液中纯化出一种组成型漆酶同功酶Ⅰ .经超滤浓缩 ,DEAE SephadexA 5 0离子交换层析 ,Bio gelP 10 0凝胶过滤纯化了该酶 .SDS PAGE分析发现 ,该酶分子量为 6 8kD ,薄层等电聚焦测得等电点为 3 5 .漆酶Ⅰ的底物范围较宽 ,以O2 为电子受体 ,可以氧化多种木素单体模型物 ,包括 2 ,6 二甲氧基酚 ,2 ,2′ 联氮 二 (3 乙基 苯并噻唑 6 磺酸 )(ABTS) ,愈创木酚 ,咖啡酸 ,阿魏酸和邻联茴香胺 .结果表明 ,该酶在木质素的生物降解中可能有重要的作用和应用价值 .

杂色云芝漆酶和发酵液降解对苯二酚研究

测定和分析了杂色云芝漆酶和杂色云芝发酵液对对苯二酚的降解反应。通过对不同底物质量浓度下杂色云芝漆酶酶学反应动力学特征分析.求得漆酶Lac A对对苯二酚的酶反应动力学方程V= 1.52C_s/(16.55+C_s)和底物抑制反应速率方程r_s=1.02/(1+12.86/C_s +C_s/137.17)。发酵液对对苯二酚的降解反应进程符合一级反应动力学方程InC=-kt+b.发酵液对对苯二酚的降解反应动力学基本符合Michelis-Menten酶学反应动力学方程V_f=1.77C_s/(3.63+C_s),研究表明Lac A与发酵液对对苯二酚的酶学反应动力学具有较大的相似性.也存在着底物抑制现象,其底物抑制的动力学方程为r′_s=1.40/(1+ 5.75/C_s+C_s/278.26)。比较漆酶纯酶Lae A和发酵液对对苯二酚反应的K_m和V_(max)数值,发现杂色云芝发酵液K_m较小而V_(max)数值较大,说明发酵液较漆酶纯酶具有更高的底物亲和力和催化效率。

杂色云芝漆酶基因(Lcc1)的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以白腐菌杂色云芝Coriolus versicolor RNA为模板,通过RT-PCR获得漆酶Leel基因的cDNA片段。构建了甲醇酵母表达质粒pMETA-Lccl载体,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16,部分阳性克隆的PCR结果表明Lccl基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上,经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母工程菌株。

镧和铈对杂色云芝生长及其漆酶活性的影响

研究了镧(La3+),铈(Ce3+)对杂色云芝(Coriolus versicolor)生长和漆酶活性的影响.结果表明,La3+和Ce3+促进了杂色云芝的持续生长.La3+浓度20μmol.L-1培养9 d时,所产漆酶能力提高26.69%;Ce3+浓度20μmol.L-1培养10 d时,产漆酶能力提高15.82%.La3+浓度在8μmol.L-1以下对发酵液的漆酶活性有促进作用,在8μmol.L-1以上对其酶活性有抑制作用;Ce3+浓度在50μmol.L-1以下对发酵液的漆酶活性有促进作用,在50μmol.L-1以上对其酶活性有抑制作用.

杂色云芝漆酶对造纸废水脱色的培养条件

对杂色云芝菌高产漆酶条件及其对造纸废水脱色条件进行了研究。结果表明,杂色云芝菌产漆酶的最佳条件为:葡萄糖10.0g·L-1,酒石酸铵1.00g·L-1,pH6.0,转速180r·min-1;脱色效果最佳的培养条件是:葡萄糖10.0g·L-1,酒石酸铵1.00g·L-1,pH6.0,温度28℃。漆酶在造纸废水脱色中起重要作用。随着培养基中碳源、氮源量的增加,菌体生物量逐渐增加,但体系中高碳氮比对造纸废水漆酶的脱色是不利的;菌体生物量与对造纸废水的脱色作用不呈正相关。

杂色云芝处理高浓度味精废水初探

研究了杂色云芝对等电提取谷氨酸后浓缩废母液处理效果,考察了浓缩废母液的不同百分比浓度和初始pH对杂色云芝脱色率、COD去除率及菌体生物量的影响,同时还考察了杂色云芝处理废母液后pH的变化情况。研究结果表明,利用杂色云芝处理高浓度味精废水,不仅可去除COD而且有脱色效果。生产的菌丝体还可进一步作为动物饲料,投资少、成本低、不会产生二次污染,还可带来一定的经济效益。对不同百分比浓度的味精废水试验发现,30%浓度的味精废水处理效果最好,COD去除率为49.26%,脱色率为56.67%,菌体干重为5.8g/L。味精废水的初始pH对处理效果有一定的影响,初始pH为5.0时,最高COD去除率为50.12%,最大脱色率为55.8%。

两种测定杂色云芝胞外多糖方法的比较

采用苯酚-硫酸法和蒽酮-比色法两种方法,分别对云芝多糖含量进行了测定,通过精密度实验、稳定性实验和回收率实验,分析考察两种测定方法的优缺点.结果表明,苯酚硫酸法是测定杂色云芝菌胞外多糖较为理想的方法.此方法与蒽酮比色法相比,其精密度更高,测得多糖平均质量浓度为339.32μg/mL,相对标准偏差为1.07%,稳定性略差于蒽酮比色法,其2h内测得的多糖含量相对标准偏差为0.52%,回收率更理想,且回收率平均值为98.04%,相对标准偏差为0.78%.此研究不仅对杂色云芝固体、液体胞外多糖的测定提供参考方法和选择依据,而且对一些食用菌多糖的测定也提供了一定参考和借鉴意义.

杂色云芝对2种染料的脱色条件研究

比较了2种不同液体限氮培养基中杂色云芝对酸性品红和亚甲基蓝的脱色效果,确定了最佳接种量。优化出的基本参数为T=34℃、进料浓度200mg/L、pH=4.5。实验结果表明:杂色云芝对进水的酸碱度具有很强的适应性,从pH2.5到10.5比较宽的区间内保持了比较稳定的高脱色率,这一点对于工程应用具有实际意义。

杂色云芝漆酶粗酶液对对苯二酚的降解及动力学分析

用杂色云芝产的漆酶粗酶液进行了对对苯二酚的降解及降解动力学的研究。结果表明:杂色云芝漆酶粗酶液对对苯二酚有较强的降解能力;杂色云芝漆酶粗酶液对对苯二酚的降解反应符合一级动力学特征。在不同的底物浓度下,具有不同的方程参数值。

杂色云芝酸溶性多糖对H_(22)荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

【目的】研究杂色云芝酸溶性多糖对H_(22)荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及可能的作用机制。【方法】首先测定杂色云芝酸溶性多糖内中性糖、葡萄糖醛酸及蛋白含量,然后以H_(22)肝癌移植瘤小鼠为模型,设置空白对照组(等量生理盐水)、模型组(等量生理盐水)、环磷酰胺(CTX)组(30 mg/kg)和杂色云芝酸溶性多糖高、中、低剂量组(280,140,70mg/kg),每天给药1次,连续给药10d,比较各组抑瘤率、脏器指数、白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)等指标;最后在光镜下观察各处理组肿瘤组织H&E染色后的形态变化和细胞凋亡情况,考察杂色云芝酸溶性多糖的抗肿瘤作用及机制。【结果】杂色云芝酸溶性多糖内中性糖含量为656mg/g,葡萄糖醛酸含量为38mg/g,蛋白含量为18mg/g。CTX组和杂色云芝酸溶性多糖高、中、低剂量组均能不同程度抑制肿瘤细胞增殖,抑瘤率分别为68.14%,55.56%,47.01%和37.52%;与CTX组相比,杂色云芝酸溶性多糖组改善了免疫器官指数(P<0.01);与模型组相比,杂色云芝酸溶性多糖组改善提高了血清细胞因子IFN-γ、TNF-α水平(P<0.01),降低了血清IL-6、ALT、BUN和CRE水平(P<0.01)。肿瘤组织H&E染色及凋亡检测结果表明,杂色云芝酸溶性多糖可促使肿瘤细胞凋亡。【结论】杂色云芝酸溶性多糖具有抗肿瘤作用,且可能是通过调节免疫能力实现这种作用的。

杂色云芝漆酶对溴酚蓝的高效降解

以杂色云芝菌(Coriolus versicolor)发酵所产漆酶为催化剂,对溴酚蓝溶液进行脱色处理。探讨了反应温度、反应体系pH、反应时间、酶加入量、溴酚蓝质量浓度及金属离子和小分子介质的添加等因素对溴酚蓝溶液脱色率的影响。实验结果表明:在反应温度为40℃、反应体系pH为4.5、反应时间为240 min、酶加入量为60U/L、溴酚蓝质量浓度为40 mg/L的条件下,溴酚蓝溶液的脱色率达到94.5%;小分子物质2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)(ABTS)或金属离子的添加对溴酚蓝溶液的脱色效果没有明显的促进作用。

杂色云芝突变株酶活力变化及遗传特性研究

和出发菌株相比较,突变菌株产酶时间缩短,酶活力显著提高.聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,突变株发酵液蛋白的种类增多,表达量提高,这表明突变株的遗传物质发生了变化.RAPD分析进一步证明,突变株和出发菌株存在遗传差异.

杂色云芝生物滤塔净化甲苯废气效果

为研究生物滤塔中优势菌种杂色云芝净化甲苯的性能。选择松树皮和火山石为生物滤塔填料,杂色云芝为功能微生物,甲苯为目标污染物,研究杂色云芝在生物滤塔中的生长情况及不同停留时间和进气载荷对去除率、去除负荷,系统压降变化的影响等。结果表明:采用强制循环挂膜法,在20 d内即可完成微生物挂膜,且在木质素氧化酶没有参与的条件下杂色云芝生物滤塔对甲苯表现出较好的去除效果。生物滤塔净化过程中气体停留时间(Gas rentention time,GRT)为148.3 s,进口负荷为7.28 g/(m^3·h)时,生物滤塔的最大去除能力为6.73 g/(m^3·h),该系统的最高去除率为92.4%;GRT为37.1s,进口负荷为58.25 g/(m^3·h)时,生物滤塔的最大去除能力为47.07 g/(m^3·h),去除率在80%以上。试验条件下,系统的压降均在500 Pa以下,说明系统的经济性良好。

杂色云芝对几种环境污染物降解的初步研究

采用三角瓶降解体系,进行了杂色云芝对不同浓度下的几种环境污染物的降解率和绝对降解量的研究。结果表明:杂色云芝对苯胺、硝基苯有一定的降解能力,对联苯胺降解能力很弱,对2,4-二硝基氯苯不降解,能较好的降解低浓度的混合甲酚。这与杂色云芝漆酶的催化降解特性有关,影响杂色云芝降解能力的因素主要是环境污染物的种类及其浓度变化。

碳源氮源对杂色云芝产漆酶的影响

目的研究碳源氮源对杂色云芝合成漆酶的影响。方法以本实验室保藏的高漆酶合成菌株杂色云芝为研究对象,首先比较不同培养方式对该菌株漆酶合成的影响,然后通过单因素实验和响应面分析实验研究了碳源和氮源对漆酶合成的影响。结果摇床振荡培养产酶效果优于静止培养,在不同的碳源与氮源中,蔗糖为该菌株产漆酶的合适碳源,合适的氮源是酵母粉,培养基中碳氮源的最佳含量为:蔗糖10.2g/L,酵母粉7.2g/L。结论碳源和氮源对杂色云芝发酵生产漆酶有很大的影响,响应面法对杂色云芝产液态发酵产漆酶条件的优化是可行的。

白腐菌Coriolus versicolor的培养及产漆酶条件的研究

从液体和固体两种培养体系出发,探索不同培养条件对白腐菌分泌漆酶的影响。液体培养体系中,白腐菌的最佳生长和漆酶分泌条件是缓冲体系起始pH值为5.8、摇瓶转速为180r/min、装液量为100mL/500mL;在所有测试的碳源中,葡萄糖为最佳碳源,在二糖中以蔗糖为碳源,漆酶酶活相对较高,而多糖(如淀粉)不利于漆酶的生成。在所有测试的氮源中,硝酸铵和酒石酸铵组合为最佳氮源,氯化铵和尿素的效果次之,蛋白胨的效果最差。当碳源与氮源质量比(C/N)大于10∶1,即高碳低氮的培养条件有利于漆酶的生成。芳香化合物诱导剂ABTS浓度为0.5～1mmol/L时,对产漆酶的影响最明显,与限氮培养基中产酶相比可提高酶活5倍,约为230IU/mL;0.5mmol/L愈创木酚、1mmol/L阿魏酸和0.05mmol/L二甲基苯胺的添加可提高酶活约2～2.5倍;0.01mmol/L黎芦醇的添加可提高漆酶酶活约1.6倍。由于酪氨酸具有酚类化合物的特点,也可作为一种无毒的天然漆酶诱导剂。菌株漆酶活力在固体培养体系明显低于在液体培养体系。

培养条件对Coriolus Versicolor菌分泌漆酶的影响

采用云芝菌(coriolus versicolor)摇瓶发酵生产漆酶,对主要的影响因素进行了优化。讨论了碳源、氮源、铜离子浓度、诱导剂、表面活性剂等各种因素对杂色云芝菌分泌漆酶能力的影响,获得了优化的培养基组成:土豆汁20%,葡萄糖20 g/L,蛋白胨4 g/L,CuSO40.5 mmol/L,KH2PO43 g/L,MgSO41.5 g/L,ZnSO450 mg/L,MnSO450 mg/L。结果表明,表面活性剂Tween-80的加入能显著提高漆酶的分泌,最佳诱导剂为ABTS。在最优条件下发酵13 d,漆酶活力可高达92.2 U/mL。