多壁碳纳米管固定化生物酶修饰电极检测杂色曲霉素的初步研究

杂色曲霉素 (ST)是一种致癌致畸的真菌毒素 ,已报道的检测ST的技术有TLC、HPLC、ELISA以及毒素基因的PCR检测技术。初步探索了酶生物传感器三电极系统对ST的电化学分析。在实验中 ,应用多壁碳纳米管作为分子识别元件ADTZ的固定化基质和传感器的电子传递体构建了Au工作电极 ,对ST进行CV和DPV分析 ,结果表明 :ST在 - 6 0 0mV位置有一明显的特征还原峰电位 ,线性检测范围是 8 32× 1 0 - 5～ 6 6 5 6× 1 0 - 5mg mL ,检测下限为8 32× 1 0 - 5mg mL ,响应时间 1 0s。

杂色曲霉素致人胚肺细胞p53及Ki-ras基因突变研究

为探讨中国恶性肿瘤高发区粮食中优势污染霉菌毒素—杂色曲霉素 (Sterigmatocystin,ST)的致癌作用 ,运用银染 PCR- SSCP方法分析了不同浓度的 ST(1μg/ ml和 3μg/ m l)对体外培养的人胚肺细胞恶性转化过程中抑癌基因 p5 3第 5、6、7、8外显子及癌基因 Ki- ras的突变情况。结果显示 ST处理后第 2 2周 ,人胚肺成纤维细胞 p5 3基因的第 8外显子和 Ki- ras癌基因均出现异常泳动带型 ,表明 ST诱发了抑癌基因 p5 3及癌基因 Ki- ras突变 ,进一步证实了 ST对人肺组织的致癌作用。

杂色曲霉素对体外培养人胚肺成纤维细胞rasp21和超微结构的影响

以人胚肺组织体外培养、流式免疫技术和电镜相结合的方法，对河北省肿瘤高发区粮食中污染的常见霉菌毒素－杂色曲霉素作用后人胚肺成纤维细胞癌基因ｒａｓｐ２１蛋白产物的表达及相应超微结构变化进行了研究。结果表明：在杂色曲霉素作用下人胚肺成纤维细胞癌基因ｒａｓｐ２１的蛋白表达明显增强。电镜观察可见杂色曲霉素处理细胞出现细胞核明显增大、异型、核膜内褶、核仁明显等一系列具有恶性肿瘤细胞特征的超微结构变化。

胃癌、肝癌高发区和低发区粮食中杂色曲霉素污染量调查

采用间接竞争酶联免疫吸附试验（ＩＣ－ＥＬＩＳＡ）测定了２０８份粮食样品的杂色曲霉素（ＳＴ）污染量，发现其中７９份含ＳＴ少于４μｇ／ｋｇ，１１１份含４～３９μｇ／ｋｇ；ＳＴ污染量高于４０μｇ／ｋｇ的有１８份，最高含３４μｇ／ｋｇ。采自胃癌、肝癌高发区的１０７份样品，有４４．９％含２０μｇ／ｋｇ以上的ＳＴ，而低发区的６１份样品只有１４．８％含ＳＴ在２０μｇ／ｋｇ以上。二者，有极显著的差异（Ｐ＜０．０１）；高发区样品的ＳＴ污染量加权平均值为（１９．６±２１．６）μｇ／ｋｇ，低发区的为（１２．２±１１．８）μｇ／ｋｇ，二者也有极显著的差异（Ｐ＜０．０１）。在同一类地区，原粮的ＳＴ污染量显著高于成品粮的；不同粮食品种之间的ＳＴ污染量有差异，按ＳＴ污染量由大到小排列为：杂粮及饲料＞小麦＞稻谷＞玉米＞面粉＞大米。就单一品种比较，来自胃癌、肝癌高发区和低发区的小麦、玉米、大米三种粮食的ＳＴ污染量之间都有显著差异（Ｐ＜０．０５），而稻谷、面粉的ＳＴ污染量差异不显著（Ｐ＞０．０５）。对其中的１６份样品按现行国家标准检测方法──薄层层析法测定ＳＴ含量，发现１５份样品的测定结果与ＩＣ－ＥＬＩＳＡ法的测定值相一致。二种测定方法的符合?

杂色曲霉素对体外培养人外周血白细胞介素Ⅱ分泌影响的研究

杂色曲霉素是我国肿瘤高发区粮食中的优势污染霉菌毒素。为探讨杂色曲霉素 (ST)对人体免疫机能的影响 ,采用双抗体夹心ELISA方法对ST作用后人外周血单核细胞 (HPBMc)培养上清液中白血细胞介素Ⅱ (IL 2 )的分泌水平进行了检测。结果表明 ,不同浓度 ( 0 0 3 12 5～ 2mg L)ST处理 2 4h后 ,体外培养的HPB Mc的IL 2分泌均受到一定程度的抑制 ,其中以较低浓度ST( 0 0 3 12 5～ 0 12 5mg L)和较高浓度ST( 1～ 2mg L)抑制作用最明显 (P <0 0 5 )。在ST 1mg L作用 1～ 64h的时间范围内 ,ST对HPBMcIL 2的分泌总体表现抑制作用。ST处理后 8～ 64h ,随ST处理时间的延长 ,对IL 2分泌的抑制作用逐渐增强 (r =0 82 2 ,P <0 0 5 )。本研究结果提示 ,ST对HPBMcIL

杂色曲霉素对人胚胃粘膜细胞p53基因致突变研究

为探讨杂色曲霉素（ＳＴ）的致癌作用，运用细胞培养、流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）和银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ等方法研究了不同浓度的ＳＴ（１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ）诱发体外培养的人胚胃粘膜细胞恶性转化情况以及此过程中抑癌基因ｐ５３在蛋白及基因水平上的变化。结果表明，ＳＴ处理４周后处理细胞增殖旺盛，并出现恶性转化灶；ＳＴ处理２４周后处理细胞可在软琼脂上形成细胞集落（ＳＴ１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ组每皿细胞集落数平均分别为１５和１７个）；ＦＣＭ检测结果表明，ＳＴ处理的细胞细胞增殖指数增高，ＤＮＡ含量增高，出现ＤＮＡ异倍体，突变型抑癌基因ｐ５３蛋白表达明显增强。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结果显示，ＳＴ处理２２周后，处理细胞ｐ５３第８外显子出现异常泳动带型。

杂色曲霉素对人外周血单个核细胞TAP1及LMP2基因表达的影响

目的:探讨杂色曲霉素(ST)对体外培养的人外周血单个核细胞(HPBMc)抗原加工递呈相关基因TAP1、LMP2表达的影响。方法:采用RT-PCR和FCM方法,分析5种浓度ST处理对体外培养的HPBMcTAP1、LMP2基因在mRNA和蛋白水平表达的影响。结果:RT-PCR检测结果表明,ST处理24h后,低浓度ST组(0.125mg/L、0.25mg/L)HPBMcTAP1mRNA相对表达量明显高于对照组,而较高浓度组(0.5mg/L、1mg/L和2mg/L)TAP1mRNA则明显低于对照组,尤以1mg/L和2mg/L组为著。FCM定量分析表明,低浓度ST组HPBMcTAP1蛋白平均表达量略低于对照组,但无统计学意义,而较高浓度组TAP1表达则明显低于对照组(P<0.05)。在0.125mg/L到1mg/L浓度范围内,各ST处理组HPBMcLMP2蛋白表达量和mRNA的相对表达量均高于对照组。结论:ST对体外培养的HPBMcTAP1mRNA表达和蛋白表达的影响按ST剂量不同而变化,在0.125～1mg/L浓度范围内ST在mRNA及蛋白水平均可剂量依赖地提高体外培养的HPBMcLMP2的表达。

杂色曲霉素诱导体外培养人外周血淋巴细胞凋亡的研究

目的：研究我国肿瘤高发区饮食污染霉菌毒素－杂色曲霉素（ＳＴ）对人免疫机能的可能影响。方法：流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）、形态学观察及ＤＮＡ电泳。结果：ＳＴ可诱导体外培养的人外周血淋巴细胞发生凋亡，并且在一定时间（２～４８ｈ）及剂量（０１２５～２．０ｍｇ／Ｌ）范围内呈正相关关系。光镜及透射电镜观察均发现了凋亡细胞典型的形态学变化，如核染色质凝集边集，凋亡小体形成等；ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳也出现特征性的ＤＮＡＬａｄｄｅｒ条带。结论：ＳＴ可诱导人外周血淋巴细胞发生凋亡。

黄曲霉毒素B_1与杂色曲霉素对HepG2细胞的联合毒性

研究了黄曲霉毒素B1(AFB1)和杂色曲霉素(ST)对人肝癌细胞Hep G2的细胞毒性及其联合毒性。体外培养人肝癌细胞Hep G2,用不同浓度梯度的AFB1(0.1、1、5、10μmol/L)和ST(0.5、2.5、5、7μmol/L)单独和联合作用于Hep G2细胞24 h或48 h,分别测量细胞活性、ATP含量、DNA受损程度、线粒体膜电位,以及活性氧含量的变化,通过统计分析得到两种毒素对Hep G2细胞的联合毒性作用。结果显示,AFB1和ST对Hep G2细胞的IC50分别为16.989μmol/L和7.258μmol/L,细胞增殖力、ATP、DNA、线粒体膜电位、活性氧等指标的理论加和值与实际值无显著性差异(P>0.05)。同时,这两种毒素及其混合物对Hep G2细胞的作用终点均可分为3类:第一类为细胞增殖力的降低;第二类包括ATP含量、DNA含量变化;第三类为活性氧含量变化和线粒体膜通透性变化。表明AFB1和ST对Hep G2细胞的联合毒性作用为加和作用。

单次灌胃杂色曲霉素对小鼠大脑细胞的影响

目的 探讨单次ig杂色曲霉素 (ST)对小鼠大脑细胞的影响。方法 采用形态学观察和流式细胞术定量检测方法 ,研究ST对BALB/c小鼠大脑神经细胞的影响。结果 病理形态学观察可见 ,ig小剂量ST(3μg·kg-1 )后 1 2h或大剂量ST(3mg·kg-1 )后6h即可见小鼠大脑皮质、丘脑、海马CA2区神经元出现胞核固缩深染、胞浆嗜酸性变、空泡变性等病理变化 ,且随剂量增大和作用时间延长 ,病变神经元逐渐增多 ;光镜下对海马CA2区病变神经元进行计数分析 ,结果表明ST处理组发生病理变化的神经元比例均高于相应对照组 ,且呈剂量和时间依赖性增高 ;流式细胞术定量检测结果表明 ,igST 3,30 ,30 0和30 0 0 μg·kg-1 1 2h后 ,小鼠脑细胞的凋亡率呈剂量依赖性增高 ;ig3mg·kg-1 的ST后 6～48h,随ST作用时间的延长 ,脑细胞凋亡率也明显增高。结论经口给予ST可导致小鼠大脑皮质、丘脑、海马CA2区神经元发生退行性病变 。

杂色曲霉素对小鼠穹窿下器室管膜细胞超微结构的影响

目的:观察杂色曲霉素(ST)对小鼠穹隆下器(SFO)室管膜细胞超微结构的影响。方法:BALB／c小鼠,单次ST(3000 μg/kg) 灌胃,分别于灌胃后1、2、4、8、16 h处死动物,用扫描电镜观察SFO室管膜的结构变化。结果:ST灌胃后1 h部分SFO室管膜表面微绒毛结构消失、细胞破损,ST灌胃后2 h室管膜出现凹凸不平、损伤加重,ST灌胃后8 h室管膜凹凸不平和破损最为明显, ST灌胃后16 h逐渐恢复。结论:提示ST对小鼠SFO室管膜细胞有明显的损伤作用。

杂色曲霉素对体外培养人胚支气管粘膜上皮的致癌作用初步研究

采用体外培养、动物接种方法研究了杂色曲霉素对体外培养的人胚支气管粘膜上皮致癌作用。结果发现，体外培养的人胚肺支气管组织块在杂色曲霉素处理后，γ射线照射的新生ＳＤ仔鼠皮下接种可见支气管粘膜及肺泡上皮增生。

杂色曲霉素对小鼠胸腺和脾脏转录因子Foxp3^+调节性T淋巴细胞的影响

目的探讨杂色曲霉素(ST)对机体免疫调节功能的影响。方法BALB/c小鼠随机分为正常对照组、溶剂对照组、ST3,30,300和3000μg·kg-1组。小鼠ip给药24h后,处死取胸腺和脾脏,采用流式细胞术测定胸腺和脾脏细胞中CD4+和CD8+T淋巴细胞及转录因子Foxp3阳性(Foxp3+)调节性T淋巴细胞的百分率,免疫组织化学法检测胸腺和脾脏组织中Foxp3+调节性T淋巴细胞数量,Western蛋白印迹法和RT-PCR分别测定胸腺和脾脏组织中Foxp3蛋白和mRNA的表达。结果溶剂对照组与正常对照组比较,小鼠胸腺和脾脏CD4+,CD8+和Foxp3+T淋巴细胞百分率均无明显差异。与溶剂对照组比较,ST3μg·kg-1组胸腺CD8+T淋巴细胞百分率降低,ST3和30μg·kg-1组脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞百分率明显升高,ST300和3000μg·kg-1组胸腺和脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞百分率无明显变化。在ST3～3000μg·kg-1内,胸腺和脾脏细胞中Foxp3+调节性T淋巴细胞百分率、胸腺和脾脏组织内Foxp3+调节性T淋巴细胞数量、Foxp3蛋白和mRNA表达均随ST浓度的增高而增加。结论ST可诱导小鼠淋巴器官内Foxp3+调节性T淋巴细胞数量增加,从而影响机体免疫耐受功能。

杂色曲霉素对人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响

目的探讨杂色曲霉素(ST)对体外培养的人外周血单个核细胞表面(HPBMc)HLAⅠ分子表达的影响。方法采用流式细胞定量术(FCM)和免疫印迹(Westernblot)分析方法,研究不同浓度ST(0.125、0.25、0.5、1和2mgL)处理后人外周血单个核细胞表面HLAⅠ分子表达的变化。结果FCM定量分析结果表明,经不同浓度ST处理24小时后,与对照组相比,各组细胞HLAⅠ的平均荧光强度均降低,以较高浓度(0.5、1和2mgL)ST处理组降低更明显(P<0.05)。在0.125mgL到2mgL的浓度范围内,随ST处理浓度的升高,HLAⅠ荧光指数逐渐降低,两者呈明显的负相关(r=-0.841,P<0.01)。免疫印迹结果也表明,随ST浓度的增高,HLAⅠ分子降低越明显。结论提示在0.125mgL到2mgL的浓度范围内,ST抑制人外周血单个核细胞表面HLAⅠ分子的表达呈现出负的剂量-反应关系。

杂色曲霉素的分离、纯化及鉴定

将两株杂色曲霉菌分别接种于4kg玉米豆粉固体产毒培养基,28℃静置培养35d。以甲醇-4％ KC1(9:1)混合液及甲醇-三氯甲烷混合液浸提杂色曲霉素(sterigmatocy stin,简称ST),再用三氯甲烷萃取,经硅胶柱层析法初步纯化。在甲醇、乙腈、乙醚、丙酮等溶剂中多次重结晶,最后得到2271.6mg淡黄色针状结晶。经过熔点测定、元素分析、四种光谱学鉴定、薄层层析及高效液相色谱鉴定,确认该晶体为ST。纯度在99.9％以上。

杂色曲霉素灌胃对小鼠外侧隐窝超微结构的影响

目的:观察杂色曲霉素(ST)对小鼠第四脑室外侧隐窝室管膜细胞结构的影响。方法:BALB/c小鼠,单次ST灌胃,分别于灌胃后1～16d处死动物,用扫描电镜观察外侧隐窝室管膜的结构变化。结果:ST灌胃后1h和2h组外侧隐窝处室管膜的纤毛稀少、粘连、倒伏;4h和8h组纤毛粘连和倒伏更加明显,并出现室管膜细胞的破损和分泌颗粒;16h组纤毛粘连变轻,纤毛数量和形态逐渐恢复到正常,分泌颗粒少见。结论:提示ST对小鼠外侧隐窝室管膜细胞有明显的损伤作用。

杂色曲霉素对小鼠穹隆下器官TNFα和TGFβ_2的mRNA表达的影响

目的观察杂色曲霉素(ST)损伤脑组织时有无肿瘤坏死因子(TNF)α和转化生长因子(TGF)β2的mRNA表达的改变。方法用BALB/c小鼠,ST3mg.kg-1灌胃,分别于灌胃后0.5,1,2,4,8和16h处死动物,用原位杂交方法观察穹隆下器官(SFO)细胞TNFα mRNA和TGFβ2 mRNA的表达。结果TNFα mRNA和TGFβ2 mRNA阳性细胞广泛分布在SFO。ST处理组从0.5h开始TNFα mRNA阳性表达细胞数缓慢上升,4h达到顶点,之后缓慢下降;TGFβ2 mRNA阳性表达细胞数从0.5h缓慢持续上升,16h达到顶点。ST组各时间点TNFα mRNA和TGFβ2 mRNA阳性细胞数均明显高于对照组。结论TNFα和TGFβ2在ST对SFO细胞损伤和修复中可能起着重要的作用。

杂色曲霉素体外对人胃粘膜的致癌作用

河北省赞皇县是胃癌高发区，我们以往的研究表明该地区胃癌高发与杂色曲霉毒素密切相关。为进一步探讨杂色曲霉毒素对人胃粘膜的致癌作用，于本研究中，用该毒素处理体外培养的人胎儿胃粘膜。处理后１８天，经流式细胞分析显示胃粘膜组织Ｓ期、Ｇ２Ｍ期细胞数和细胞增殖指数增大；接种于；γ－射线处理的新生ＳＤ大鼠皮下可存活生长，形态学是重度不典型增生。结果表明杂色曲霉毒素对人胃粘膜有致癌作用。

杂色曲霉素对体外小鼠腹腔巨噬细胞白细胞介素12表达与分泌的影响

目的 探讨杂色曲霉素(ST)对巨噬细胞免疫功能的影响。方法 分别采用半定量逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附法,研究0 .12 5 ,0 .2 5 ,0 .5 ,1.0和2 .0mg·L- 1ST预处理对小鼠腹腔巨噬细胞白细胞介素(IL) 12mRNA表达及其蛋白分泌的影响。结果 在0 .12 5～1.0mg·L- 1范围内,ST处理对小鼠腹腔巨噬细胞IL 12p4 0和IL 12p35mRNA的表达均有一定的抑制作用。但在蛋白水平,对IL 12分泌的影响不明显。当ST浓度达到2 .0mg·L- 1时,可明显抑制IL 12p4 0mRNA的表达及IL 12的分泌。结论 ST可抑制巨噬细胞IL 12的表达或分泌,提示ST可能在一定程度上对机体的细胞免疫功能产生不利影响。

日光消除杂色曲霉素致突变作用的研究

采用小鼠微核试验和体外人外周血淋巴细胞程序外ＤＮＡ合成试验（ＵＤＳ）探讨了日光消除杂色曲霉毒素致突变性的作用。结果表明，经日晒８ｈ，杂色曲霉培养物的提取液不能诱导微核出现率升高和ＵＤＳ；相反，未经日晒的培养物的提取液则可明显引起微核率升高和ＵＤＳ。