基因工程产品的N末端均一性及其中残留的痕量杂质蛋白的分析

利用Edman降解法,辅之以邻苯二甲醛阻断等技术,在蛋白/多肽测序仪-PTH氨基酸分析仪上微量自动测定了在大肠杆菌系统获得高效表达的重组人γ干扰素、α 2干扰素和白细胞介素-2等多种基因工程产品的N末端氨基酸序列。根据氨基酸色谱分析的原始资料,对上述蛋白质样品的N末端均一性进行了细致分析。在此基础上,借助序列库检索比较等计算机方法检定了这些样品中可能残留的痕量杂质蛋白,并对分析痕量残留蛋白的一般方法进行了讨论。分析结果表明重组人γ干扰素N末端均一;而α 2干扰素和白细胞介素-2的N末端不均一,其中主要含大致等量的N末端带有蛋氨酸与不带蛋氨酸的两种分子,仅在个别送检样品中发现痕量N末端丢失一个氨基酸的分子。通过在序列库中检索所测出的一段八肽疑似序列,推断在一批送检样品中含有痕量的卵清溶菌酶,经进一步纯化样品并测序后得以证实。本文结果为进一步优化和确定有关产品的生产流程并建立产品质量控制的标准提供了重要依据。

中空纤维离心超滤-高效凝胶排阻色谱法测定青霉素V钾中蛋白杂质

建立了一种采用中空纤维离心超滤(HFCF-UF)-高效凝胶排阻色谱法(HPSEC)对青霉素V钾中的残留蛋白进行检测的方法。样品用HFCF-UF进行富集,采用HPSEC进行分析,色谱柱为TSK gel Super SW2000凝胶色谱柱(300×4.6mm,4μm),流动相为0.06mol/L NaCl-0.02mol/L NaH_2PO_4(pH=7.0),流速为0.3mL/min,紫外检测波长为220nm,柱温为室温。对照品牛血清白蛋白(BSA)在1.0~100.0μg/mL内线性关系良好(R2=0.999),回收率均大于87%,检测限为3.03ng/mL,经HFCF-UF富集处理后,富集倍数(EF)高达99倍。结果表明,该方法操作简便、结果准确、灵敏度高,为同类药物中的大分子蛋白检测提供了有效手段。

基因重组药物蛋白类杂质检测及质量控制

生物技术药物中蛋白类杂质是最普通、最复杂也是最具潜在危害性的杂质,去除生物药品中所有蛋白杂质也是不可能的.为增加产品安全性必须加强对生物制品中蛋白类杂质的质量控制.目前对生物技术药物蛋白类杂质检测及质量控制方法包括:免疫学分析、凝胶电泳、等电聚焦电泳、二维电泳及质谱技术、毛细管电泳、高效液相色谱等.将生物药品中相关蛋白类杂质控制在合理范围内,既可增加用药安全性,又能增强药物生物学活性,是该类药品成功应用于临床的必然要求.

硫酸软骨素中蛋白质类杂质去除方法研究

目的从工业生产角度分析与硫酸软骨素(CS)共存的蛋白类杂质去除方法。方法采用蛋白酶水解从软骨组织中释放出CS糖链,经稀碱处理去除与糖链共价连接的肽段,乙醇沉淀去除蛋白质降解产物,得到CS。结果软骨经过蛋白酶充分水解后,经乙醇沉淀可将CS中蛋白质含量降低至3%以下,继续使用稀碱处理可将CS中蛋白质含量降低至0.1%以下。结论使用乙醇沉淀和稀碱处理,可有效控制CS中蛋白质的含量。

注射用门冬酰胺酶蛋白质杂质研究

目的:考察注射用门冬酰胺酶中蛋白质杂质情况。方法:采用蛋白质分离纯化系统对蛋白质样品进行分离,采用蛋白质电泳及UPLC-Q-TOF-MS法分别对2个厂家样品中杂蛋白组分进行分析。结果:厂家A样品中共检出2种杂蛋白,杂蛋白总量为2.2%;厂家B中共检出19种杂蛋白,杂蛋白总量为7.2%。两个厂家中的杂蛋白均来源于大肠埃希菌。结论:建立的杂蛋白分析检测方法能有效检测出注射用门冬酰胺酶中蛋白质杂质的含量与来源。

克拉维酸钾及主要原料中大分子蛋白杂质的测定

建立了凝胶排阻色谱对克拉维酸钾及其原料克拉维酸叔辛胺中的残余蛋白进行检测的方法。采用TSK gel G3000 SWXL凝胶色谱柱(5μm,7.8×300 mm),流动相为磷酸盐缓冲溶液,流速为0.8 m L/min,紫外检测波长为220 nm。对照品牛血清白蛋白(BSA)在0.249~49.9μg/m L内线性关系良好(R2=0.9997),平均回收率为101.2%,RSD为0.7%,检测限为0.05μg/m L。方法为同类药物中的大分子蛋白检测提供了有效手段。

蛋白A亲和层析法纯化单克隆抗体工艺的优化

治疗性单克隆抗体药物已成为生物医药领域市场最主要的产品类别。蛋白A亲和层析作为第一步捕获抗体蛋白最为有效的手段仍然在现有单克隆抗体纯化平台中占据主导地位。在本研究中,首先开发了一种基于低p H处理抗体细胞回收液的新型细胞液回收技术,该技术能有效去除宿主相关污染物(非组蛋白宿主杂质蛋白、组蛋白、DNA、蛋白聚合物等),同时保证较高的抗体回收率。通过该技术有效预处理后,蛋白A纯化效率可提高10倍左右,并且有效避免了抗体洗脱液中和后浊度的上升,大大减轻了后续蛋白纯化的压力。同时我们也对酸性处理中各种宿主杂质去除机制进行了研究。然后,预处理的洗脱液再经一步Capto adhere色谱纯化,非组蛋白宿主杂质蛋白降低至5 ppm、DNA小于1 ppb、组蛋白降低至检测限以下、蛋白聚合物小于0.01%。总过程抗体蛋白收率87%。该两步法抗体纯化技术可有效集成至当前主流抗体纯化平台,具有良好的大规模应用价值。

肝素中残留蛋白质检测国际协作研究

目的:评价美国药典肝素中残留蛋白质检测新方法的适用性,收集多批原料药检测数据以便确定适合的限度。方法:采用Lowry法及加入去除干扰物质的前处理过程的Lowry法对美国药典委员会提供的2个测试样品及2个国内生产厂家的10批肝素钠原料药进行了检测。结果:中检院2个测试样品结果符合USP要求,提交的实验数据全部被采纳。全球共14个实验室提交了141批肝素钠原料药结果,除1个实验室不符合系统适用性要求,数据未被采纳外,其余原料蛋白含量均小于0.1%。结论:美国药典新的肝素中残留蛋白质检测方法及限度是可行的,对预实验蛋白质含量超过0.1%的样品,进行去干扰物质预处理,将残留蛋白质限度从"不得过1.0%"提高至"不得过0.1%"。