基于硼氢化钠原位还原的纳米金杂化酶的制备及催化阿魏酸甘油酯合成

建立了一种基于硼氢化钠原位还原法制备纳米金杂化酶用以合成阿魏酸甘油酯的方法,使杂化酶的催化活性、稳定性及结构的刚性皆有所提高.利用硼氢化钠原位还原法制备了NaBH_(4)@AuNPs-CRL杂化酶,通过单因素实验得到了最优的杂化条件,并利用荧光光谱、红外光谱、X-射线电子能谱、透射电镜等方法探究了杂化前后酶结构的变化.研究表明制备的NaBH_(4)@AuNPs-CRL杂化酶蛋白二级结构中α-螺旋含量减少、β-折叠含量增加,杂化酶比活性为4.91±0.12 U∙mg^(-1),与游离酶相比提高了66.44%,最佳条件下催化合成阿魏酸甘油酯的转化率为98.39%±3.65%,批式操作稳定性实验表明杂化酶的稳定性有较大提升.

纳米金颗粒生物杂化酶制备及其催化阿魏酸淀粉酯合成研究

以玉米淀粉,阿魏酸乙酯为原料,南极假丝酵母脂肪酶(CAL)为直接催化剂,借助CAL对氯金酸溶液有还原作用制备纳米金杂化南极假丝酵母脂肪酶(CAL-AuNPs),提高酶催化反应活性进而实现阿魏酸淀粉酯的高效合成。以纳米金在紫外光谱中的特征峰吸光度值为指标,确定CAL-AuNPs的最佳制备条件为:杂化时间24 h,温度35℃,CAL-AuNPs添加量为0.6 g,氯金酸溶液浓度为0.1 mg/mL。利用分光光度计法测定淀粉取代度,并以取代度为指标探究阿魏酸淀粉酯的最佳合成条件,实验结果表明,当反应温度为60℃,底物比为1∶3(淀粉:阿魏酸乙酯),反应时间24 h,有机溶剂添加量为10 mL,CAL-AuNPs添加量为6%时,阿魏酸淀粉酯合成效果最佳,取代度最高为0.2654。且当阿魏酸淀粉酯浓度为3 mg/mL时其抑制DPPH自由基能力最强,抑制率为47.58%。

杂种优势的一种可能的分子机理——杂合酶的协同效应

根据酶的结构与催化功能关系原理，提出了杂种优势的一种分子机理的假设，即杂合酶的协同效应，显性互补和异质等位基因互补是其中两个特例．应用杂合酶的正负协同效应能够很好地解释杂种优势的正负性和强弱性．杂合酶的特性与杂种优势的许多性质是一致的．杂合酶的活性多态性得到了同工酶的验证，其中的杂合酶活性强度与杂种优势有很强的正相关．从多聚酶的亚基间相互作用所产生的构象变化的传递形成的催化反应的协同性，讨论了杂合酶产生协同效应的可能性，以及与杂种优势之间的关系．已有许多间接证据暗示基因→酶→协同效应→杂种优势这机制存在的可能性．

杂粕溢多酶在肥育猪生产中的应用

试验选用健康,体重40 kg左右的杜×长×大三元杂交猪64头随机分成8组,每组8头。日粮中杂粕含量为12.5％和20.5％,杂粕溢多酶的添加量分别为0％.0.05％,0.10％和0.15％。试验结果表明:日粮中杂粕含量越高,肥育猪的生长速度越慢,饲料转化效率越低;在相同杂粕含量的日粮中,日增重、饲料转化效率随着杂粕溢多酶添加量的增加而提高;在不同杂粕含量的日粮中添加相同量的杂粕溢多酶,杂粕含量少的日增重和饲料转化效率提高。杂粕型日粮中添加杂粕溢多酶能提高肥育猪的生长速度,提高饲料转化率,缩短饲养时间。

杂粕型日粮中添加杂粕溢多酶对肥育猪生长、饲料转化率的影响

日粮中杂粕含量相同而杂粕溢多酶添加量不同时,肥育猪日增重和饲料转化率随着杂粕溢多酶添加量的增加而提高。在不同杂粕含量的日粮中添加相同量的杂粕溢多酶,杂粕含量少的日增重高,饲料转化率也高。在杂粕型日粮中添加杂粕溢多酶,能提高肥育猪的生长速度和饲料转化率。

共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应在呼吸道副黏病毒科病毒诊断中的应用

采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应(CODEHOP PCR)体系和商品化RV12试剂盒对急性呼吸道感染患儿下呼吸道标本中的副黏病毒科病毒进行检测,比较CODEHOP PCR与RV12试剂盒检测结果的符合率和敏感度,观察CODEHOP PCR在临床呼吸道标本中对副黏病毒诊断的应用价值,进一步探讨具备检测已知呼吸道病毒和未知新病毒特点的CODEHOP PCR在呼吸道疾病谱和未知潜在呼吸道病毒诊断中的推广价值。采集2011年上海市儿童医院因急性呼吸道感染住院的患儿下呼吸道标本572份,分别采用2种方法对副黏病毒进行检测。CODEHOP PCR检测出阳性标本113例,阳性率为19.76%;RV12试剂盒检测出阳性标本102例,阳性率17.83%;2种方法检测符合率为85.39%。以10倍倍比稀释呼吸道合胞病毒A(RSVA)感染的细胞收获液,检测结果显示,CODEHOP PCR和RV12试剂盒检测下限分别为10-8和10-6。CODEHOP PCR具备简便、易操作和测序精度高等特点,适合疾病预防系统和临床检验科使用。该方法与一些新兴的高通量快速分子诊断技术结合,可提高检测灵敏度,具有高通量、快速检测和筛查未知新病毒的优势,在呼吸道病原体检测领域值得进一步优化和推广。

微波强化纳米金杂化CRL脂肪酶催化甾醇油酸酯的合成

为进一步提高植物甾醇的脂溶性、降低熔点,提出了一种在微波辐射条件下、利用纳米金杂化CRL脂肪酶为催化剂的植物甾醇油酸酯的合成方法.以植物甾醇的转化率为指标,通过响应面法确定合成植物甾醇酯的最佳工艺条件,并对最优条件进行了验证.微波强化纳米金杂化CRL脂肪酶催化植物甾醇油酸酯的最优条件为:AuNPs粒径为15 nm、AuNPs-CRL杂化酶的添加量为8%、微波功率为320 W、反应时间为64 min,在此优化条件下测得植物甾醇的转化率为91.24%±0.42%,收率为83.73%,与预测值吻合度良好.

重组人SOD2/3杂合酶的制备及其生物活性初探

为获得重组SOD2/3杂合酶,以及观察SOD2/3能否转导入宫颈癌细胞,抑制肿瘤细胞的增殖,构建了原核表达载体pET-SOD2/3,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达获得N端带有6个组氨酸标签的SOD2/3杂合酶;用Ni柱金属螯合亲和层析纯化重组SOD2/3;利用肝素柱层析验证SOD2/3的肝素靶向性;将纯化后的融合蛋白加入体外培养的宫颈癌细胞,通过FITC和MTT实验观察杂合酶SOD2/3的转导能力及其在细胞内的活性。成功构建了SOD2/3杂合酶的表达载体,重组SOD2/3表达量占菌体总蛋白30%左右;金属螯合亲和层析一步纯化,回收率在70%以上,纯度达90%左右;重组酶能与肝素亲和层析结合,说明杂合酶SOD2/3有肝素靶向性;细胞实验证实SOD2/3较SOD2能更好地抑制Hela细胞生长。获得了较纯的重组SOD2/3杂合酶,该酶能直接以天然有活性的形式转导人宫颈癌细胞内并抑制其细胞增殖,具有很好的作为肿瘤治疗、抗氧化损伤药物的潜力。

杂粕酶在肉鸭杂粕饲粮中的应用效果试验

试验旨在研究以玉米-杂粕为基础的樱桃谷肉鸭日粮中,添加不同水平杂粕酶对肉鸭生产性能和养分利用指标的影响。结果表明:①随着添加酶剂量的增加,日增重有提高的趋势,日耗料变化规律性不强,添加水平为200g/t时,料肉比显著好于不加酶组(0.01<P<0.05),增重饲料成本与不加酶组相当(0.05<P<0.1);②添加水平为200g/t时,可以极显著提高樱桃谷肉鸭的粗蛋白质利用率(P<0.01),显著提高能量利用率(0.01<P<0.05),粗脂肪利用率与不加酶组相当(0.05<P<0.1),干物质和粗纤维比不加酶组提高了,但差异不显著(P>0.05);③日粮中添加酶制剂可以不同程度的提高肉鸭的氨基酸利用率。添加水平为200g/t时,极显著提高了总必需氨基酸、总氨基酸、亮氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、胱氨酸的利用率(P<0.01),显著提高了异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸的利用率(0.01<P<0.05);④随着添加酶水平的增加,肉鸭真代谢能和粗蛋白质利用率改善程度提高了。

重组人SOD2/3杂合酶原核表达及纯化方法的研究

目的摸索工程菌的表达条件并分离纯化,获得高活性的重组人SOD2/3杂合酶（rhSOD2/3）。方法利用含有质粒pET-28a-SOD2/3的工程菌诱导表达rhSOD2/3,考察诱导温度、诱导剂浓度、Mn2＋浓度与加入时机对重组酶表达量与活性的影响;利用金属螯合亲和层析纯化rhSOD2/3。结果重组酶的表达量占菌体总蛋白40%~50%,最佳表达温度15℃、诱导剂浓度0.5 mmol/L,Mn2＋浓度2.5 mmol/L,表达时间16 h,亲和层析能较好的纯化rhSOD2/3,比活从粗酶液220 U/mgpr提高到930 U/mgpr以上。结论成功获得了rh SOD2/3最适的表达条件及纯化方法。

构建杂化酶体系解析对羟基苯乙酸脱羧酶小亚基的功能

对羟基苯乙酸(HPA)脱羧酶是一类甘氨酸自由基脱羧酶,催化前体对羟基苯乙酸或吲哚乙酸的脱羧反应,形成终产物对羟基甲苯和对甲基吲哚。由于其蛋白质结构中小亚基(HpdC)的存在,使其显示了一些不同于其他已知的几种甘氨酸自由基体系的特性,被认为是一类新型的甘氨基自由基酶体系。前期的研究结果初步显示了HpdC在整个脱羧酶体系中的重要性,但缺乏系统的实验验证。通过构建系列杂化脱羧酶(包括组合杂化酶体系与嵌合杂化酶体系)高表达质粒,对相应的编码蛋白质进行分离纯化以及酶活性检测等,探究了小亚基在整个脱羧酶体系中的功能。研究结果证明,小亚基HpdC的存在,一方面直接影响整个编码蛋白质的溶解性及复合物的稳定性,另一方面则通过介导脱羧酶高级聚合状态的形成,决定着酶的催化活性。

杂粕型饲粮添加杂粕酶对肉鸡生产性能和经济效益的影响

本试验选择21日龄AA肉鸡360羽,研究在玉米-杂粕型饲粮中添加杂粕酶对其生产性能和经济效益的影响。试验采用单因子完全随机分组设计,共设3个处理,分别饲喂玉米-豆粕型饲粮(正对照)、玉米-杂粕型饲粮(负对照)和玉米杂粕加杂粕酶饲粮(试验组),每个处理组设3个重复,每个重复40只。试验结果表明:饲粮中添加酶组比杂粕饲粮组日增重提高8.07%(P<0.05),料肉比降低12.02%(P<0.05),增重饲料成本降低了22.63%(P<0.01);与豆粕型饲粮组相比,日增重、日采食量和料肉比差异不显著(P>0.05),增重饲料成本显著降低(P<0.05)。说明在肉鸡玉米-杂粕型饲粮中添加杂粕酶可以保持生产性能不变,降低生产成本,提高经济效益。

重组超氧化物歧化酶1/3杂合酶在大肠杆菌中表达的优化

目的获取活性高的重组SOD 1/3杂合酶。方法用含pET-SOD 1/3的工程菌诱导表达重组SOD 1/3杂合酶,通过分析SDS-PAGE及SOD酶活性,考察诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、Cu 2+、Zn 2+浓度对重组酶表达量和活性的影响。结果正交试验表明,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在A600=1.2时诱导,Cu2+、Zn2+浓度分别为2.4 mmol/L,诱导温度15℃,诱导时间12 h,能获得高活性重组SOD 1/3,其比活性为1681U/mg。结论培养温度和Cu2+、Zn2+浓度是优化表达的最主要因素。降低诱导温度有利于重组酶的可溶性表达,添加Cu2+、Zn2+能促进重组酶活性提高。

杂粕型日粮中添加杂粕酶对肉鸭生产性能的影响

本试验旨在研究以添加杂粕的樱桃谷肉鸭日粮中,添加不同水平杂粕酶对肉鸭生产性能的影响。结果表明:添加酶制剂后,日增重有明显的提高,料肉比显著好于不加酶组(0.01<P<0.05)。

一步法分离纯化限制性核酸内切酶BamHI

本文提出了一个迅速简便纯化BamHI的方法,即一步肝素——琼脂糖亲和层析法。

超声结合血清肌酸激酶、同工酶检测对胎盘植入的诊断价值

目的:探讨超声联合血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶杂化型(CK-MB)及肌酸激酶同工酶肌肉型(CK-MM)检测对胎盘植入的诊断价值。方法:回顾性收集2017年8月—2019年8月在本院产科产前检查并住院分娩、存在胎盘植入高危因素的95例孕妇临床资料,根据术中诊断及术后胎盘病理检查结果分为非胎盘植入组(n=62)和胎盘植入组(n=33)。采用彩色多普勒超声诊断仪,于产前腹部超声检查胎盘;使用酶联免疫吸附法检测血清CK、CK-MB、CK-MM水平并绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析对胎盘植入的诊断价值。结果:胎盘植入组超声诊断符合率(91.9%)与非胎盘植入组(84.9%)比较无差异(P>0.05),血清CK(117.96±34.08 U/L)、CK-MB(9.04±2.55 U/L)、CK-MM(98.75±26.49 U/L)均高于非胎盘植入组(P<0.05)。血清CK、CK-MB、CK-MM水平诊断胎盘植入的ROC曲线下面积分别为0.916、0.821、0.869,最佳截断值分别为92.35 U/L、6.41 U/L、76.09 U/L,超声联合血清CK、CK-MB、CK-MM检测的准确度(91.6%)、灵敏度(93.9%)、特异度(90.3%)均高于单独检测。结论:超声联合血清CK、CK-MB、CK-MM检测可提高产前胎盘植入诊断的准确度和灵敏度。

青霉素G酰化酶的亚基重组

青霉素G酰化酶在半合成β-内酰胺类抗生素工业中催化关键反应。将来源于Esherichia coli的α亚基分别与Kluyvera citrophila,Providencia rettgeri,Alcaligenes faecalis的β亚基重组得到三种杂合酶,杂合酶表达量随野生型PGA同源性的减小而降低,E.coli和A.faecalis氨基酸序列的相同性低至41%,其杂合酶仍然具有水解3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸的活力。

香灰菌杂合B型血红素过氧化物酶(As.APx-CcP)基因的克隆及原核表达

本研究基于JGI数据库中香灰菌的同源序列设计兼并引物扩增基因保守区,随后通过FPNI-PCR分别扩增保守区两侧侧翼序列,得到基因全长。该基因全长1 845 bp,由四个外显子和三个内含子组成,编码区1 596 bp,编码531个氨基酸,其中前21个为信号肽。通过RedOxiBase数据库比对,认为该基因属于I型过氧化物酶中的Ascorbate-cytochrome c peroxidase (APx-CcP)亚家族,与炭团菌EC38和CO27-5亲缘关系最近,序列一致率达到77%~82.5%。通过大肠杆菌表达系统,成功在体外表达了As.APx-CcP重组蛋白,优化了表达条件,表达出大小为63 kD的重组蛋白,对超声后上清蛋白和复性后蛋白测量了抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APx)以及过氧化物酶(peroxidases, PODs)活性,均未显示出吸光度变化,即没有显示出APx和PODs活性。本研究成功克隆As.APx-CcP基因、初步探索了重组蛋白的酶学性质,从序列角度分析了蛋白失活的可能原因,为今后挖掘As.APx-CcP的功能,探究As.APx-CcP在银耳伴生过程中的作用以及未来银耳的良种改造奠定了基础。

体外分子定向进化研究进展

体外定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略 ,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下 ,通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选 ,获得具有改进功能或全新功能的蛋白质 ,使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现 ,因而是发现新的生物活性分子和反应途径的重要方法 ,已在短短几年内取得了令人瞩目的成就 .

甘油脱水酶的理性设计:基因杂合改善酶的性质

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注.以弗氏柠檬酸菌和克雷伯氏菌的总DNA以及宏基因组为模板,克隆并表达了3个不同来源的甘油脱水酶基因,前两者均有活力,而后者则没有活力.为了改造甘油脱水酶使其更有利于工业化生产,通过同源建模(homology modeling)构建了这3个甘油脱水酶的三维结构,并利用一些生物信息学软件对这3个甘油脱水酶进行亚基之间的杂合改组(gene swapping)的理性设计,根据设计结果对这3种不同来源的甘油脱水酶的大、中小亚基基因分别进行了克隆.通过基因交换的方法对甘油脱水酶大、中小亚基进行了杂合,得到6种异源亚基杂合酶.部分杂合酶的酸碱稳定性、热稳定性及Vmax得到了明显的改善,同时杂合改组使本没有活力的来源于宏基因组的甘油脱水酶具有了活力而且杂合酶的热稳定性也得到了显著提高.根据构建的三维结构分析了结构差异对酶学性质的影响.