猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素 (pGH)基因的cDNA进行测序 ,得到 pGHcDNA的全序列 ,并与Seeburg等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白XIV启动子的转移载体质粒 pSXIVVI+ X3/ 4构建出含 pGH基因的重组质粒 pX3/ 4 pGH。将 pX3/ 4 pGH与致死缺失型线性化AcMNPV OCC- DNA共转染Sf9细胞 ,构建出既能形成多角体又能表达 pGH基因的苜蓿丫纹夜蛾核多角体重组病毒AcMNPV pX3/ 4 pGH OCC+ 。感染重组毒株的Hi 5细胞可溶蛋白及其培养上清的SDS PAGE和Westernblot的分析结果表明 ,感染细胞的蛋白电泳带的 2 0 .7kDa处有一条猪生长激素特异带 ,但培养上清中没有。凝胶黑度扫描估测结果显示 pGH蛋白占细胞可溶蛋白的 4 .4 8%。

伪狂犬病病毒鄂A株囊膜蛋白gD基因在杆状病毒载体系统中的表达研究

克隆了伪狂犬病病毒鄂A株囊膜蛋白gD基因并进行了序列分析 ,与国际标准毒株Rice株相比 ,两者之间核苷酸序列同源性为 98% ,推导氨基酸序列同源性为 97% .利用杆状病毒GST融合载体系统对其进行了高效表达 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹均证明了表达产物为 71ku的GST gD融合蛋白 ,其产量占细胞不溶蛋白量的 2 0 %左右 .以GST gD融合蛋白作为抗原进行小鼠免疫保护实验 ,结果表明表达的GST gD融合蛋白具有较好的免疫原性 ,不仅能诱导小鼠产生血清抗体 (1∶12 8) 。

昆虫杆状病毒表达载体系统的研究及应用

昆虫杆状病毒表达载体系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工,并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品,该系统的建立和发展,被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。文章介绍了该系统的产生、发展和技术原理,同时概述了该系统在基础研究、医药和农林业等领域的应用情况。

人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf_9细胞中的表达

对人胰岛素基因组基因真核表达载体 ( p CMA/m INS)进行 Xho 酶切 ,回收的含人胰岛素基因组基因的 1 60 8bp片段与线性化的杆状病毒载体 p Fast Bac 进行连接 ,获得重组载体 p Fast/m INS。将该重组载体转化 DH1 0 Bac感受态细菌 ,在体内进行重组 ,并经 2次抗性与蓝白斑筛选 ,得到杆状病毒重组载体 Bacmid/m INS。将该载体转染 Sf9细胞 ,获得了重组杆状病毒 ,经 Tricine-SDS-PAGE和 Western-blotting检测 ,重组杆状病毒在 Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原 。

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。

新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

目的 采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果 表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。

植酸酶基因在家蚕-杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillusniger 96 3克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫 -杆状病毒表达系统中表达 ,SDS PAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到 1.4 3g L血淋巴液和 1.90g L血淋巴液。酶活性测定结果表明 ,在蚕体和蛹的表达活性分别为 4 .6 7× 10 8u L血淋巴液和 5 .99× 10 8u L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为 5 0～6 0℃ ,最适pH值为 5 .5～ 5 .0和 2 .5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性 ,可以用于生产饲用植酸酶。

猪生殖和呼吸综合征病毒B_(13)株ORF7基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用单管RT PCR方法扩增猪生殖和呼吸综合征病毒 (PRRSV)分离株B13 株包括ORF7基因的片段 ,并对其序列进行了测定 ,结果PRRSV分离株B13 ORF7基因长度为 384bp ,编码 12 8个氨基酸组成的 15kD蛋白。与已发表的PRRSVLV株、VR 2 332株进行同源性比较 ,发现核苷酸同源性分别为 99 2 %、5 9 4% ;氨基酸同源性分别为98 4%、5 4 7%。表明PRRSV分离株B13 在基因结构上可能与LV株同属于欧洲亚群。同时构建了重组转移载体质粒 pAcGHLT B ORF7,用该重组转移载体质粒与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV SVI-G)基因组DNA(baculogoldlinearizedbaculovirusDNA)共转染草地夜蛾 (Spodoptcrafrugiperda ,Sf9)细胞 ,得到重组病毒AcMNPV OCC- GST 6xHis ORF7。在感染了重组病毒的Sf9细胞中检测到分子量为 46kD的ORF7基因的GST融合蛋白表达产物 ,能被猪抗PRRSVB13 株多克隆血清所特异识别。

口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分 2B编码区的目的基因片段 ,经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后 ,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体 pFastBacHT连接 ,得到了重组质粒 pFB P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后 ,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,经抗性及蓝白斑筛选 ,得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体 ,将其命名为Bacmid P12X3C3D ;提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞 ,最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。

PRRSV兰州分离株ORF3和ORF5基因的克隆与序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中国代表株CH-1a的基因组序列，设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物，利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株（Lanzhou株）的ORF3和ORF5基因，并对其进行序列测定，同时与已发表的13株PRRSV进行同源性比较。将扩增的PRRSV Lanzhou株ORF3、ORF5基因分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTA上，将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒pFastBacHTA-ORF3、pFastBacHTA-ORF5分别转化到DH10Bac感受态细胞。结果显示，ORF3、ORF5基因长度分别为765bp、603bp，发现核苷酸的同源性分别为88.0％—99.2％、87.3％—99.0％，获得了重组转座子rBacmid-ORF3、rBacmid-ORF5。

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT＿PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS＿103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18＿T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindIII,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18＿T＿Hrb＿1/env,对其进行PstI酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb＿1gp85基因的997bp片段,应用BactoBac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFastBacHTA进行连接,获得重组载体pFASTBacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。

仙台病毒F基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达及抗原性分析

为真核表达仙台病毒(SeV)融合蛋白(F)基因,本研究根据GenBank登录的SeV F基因序列设计合成一对特异性引物,以pMD18-T-F阳性重组质粒为模板扩增F基因,并将其克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac HTa中,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆粒rBacmid-F,经PCR鉴定正确将rBacmid-F转染Sf9细胞,连续传代后,细胞病变明显。经SDS-PAGE分析,成功表达了相对分子量为65ku左右的F蛋白,western blot和ELISA分析表明重组F蛋白具有良好的抗原性。

猪传染性胃肠炎病毒S基因杆状病毒/昆虫细胞表达系统重组质粒的构建

用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC—S。用DH10BAC对BAC—S进行转位,获得重组质粒pBAC—S。根据S基因酶切位点分析结果及杆状病毒(Bac-ulovirus)转位区结构特点,用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定,并用特异性和通用引物进行PCR分析,证明该重组质粒为含有TH-98株完整S基因的可直接在昆虫细胞进行表达的感染性重组质粒。

杆状病毒多基因表达系统介导的轮状病毒样颗粒表达与组装

目的构建能同时表达轮状病毒vp2、vp6、vp7基因的重组家蚕杆状病毒,并在BmN细胞中进行初步表达。方法利用MA104细胞繁殖人A组轮状病毒,RT-PCR扩增病毒结构蛋白vp2、vp6、vp7基因,连接至转移载体pFBDM和pUCDM中,同时引入含IE1启动子的绿色荧光蛋白基因利于检测感染和表达量,再分别通过Tn7及Cre-LoxP重组构建重组病毒。为方便检测基因的表达,在VP7的C-末端添加6-组氨酸(6-His)标签,可通过ELISA等方法快速检测目的基因表达。结果扩增获得了轮状病毒三个结构蛋白基因,构建了能高效组装轮状病毒样颗粒的重组表达载体,ELISA检测VP7得到了表达,在BmN细胞中观察到病毒样颗粒。结论成功构建杆状病毒多基因的表达系统,为生产多亚基蛋白复合物,研究大分子结构提供借鉴。

弓形虫P30基因在昆虫杆状病毒载体体系中的初步表达

将弓形虫主要表面抗原（Ｐ３０）基因插入转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后将重组质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｐ３０ＤＮＡ与粉纹夜蛾核形多角体病毒ＴｎＮＰＶＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞（Ｓｆ），通过同源重组和空斑纯化，得到重组病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０．对重组病毒感染的Ｓｆ细胞及银纹夜蛾幼虫进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示：Ｐ３０基因在Ｓｆ细胞及虫体中得到了表达，表达产物具有特异的免疫反应性。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。

意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

利用BactoBac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA2,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA2基因的重组病毒rBacmid-AmPLA2的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA2。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞,在细胞中表达AmPLA2。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×HisTag融合表达的产物蛋白分子量约为18kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5·35%。Westernblot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA2抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6·13μmol·min-1·mg-1。

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)VP2基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEVVP2基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blotting鉴定。结果成功克隆MEVVP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在Bac-To-Bac杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。

用杆状病毒载体系统表达禽畜传染病病毒基因研究概况

用杆状病毒载体系统表达禽畜传染病病毒基因研究概况陈茹（广州动植物检疫局，５１００１０）杆状病毒（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）属杆状病毒科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ），因病毒粒子呈杆状而得名，是一环状双链ＤＮＡ病毒，基因纽约为１３０Ｋｂ。本科下分两个亚科...