意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

利用BactoBac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA2,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA2基因的重组病毒rBacmid-AmPLA2的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA2。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞,在细胞中表达AmPLA2。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×HisTag融合表达的产物蛋白分子量约为18kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5·35%。Westernblot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA2抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6·13μmol·min-1·mg-1。

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。

人CD4胞外区蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达纯化及性质鉴定

目的:通过条件优化实现人CD4蛋白胞外区在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的高效表达,并对纯化获得的人CD4蛋白胞外区进行抗原性与免疫原性分析。方法:通过选择人CD4分子胞外片段构建重组杆状病毒(p Ac-CD4),然后感染昆虫细胞进行蛋白的表达,采用镍离子亲和层析纯化。运用SDS-PAGE、Western blot、体积排阻色谱、ELISA、SPR法等分析纯化得到目的蛋白的理化性质和抗原性。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB/c小鼠,监测小鼠免疫血清的抗体生成。结果:经纯化可获得纯度90%以上的人CD4蛋白,每升细胞培养液最终可获得11.2 mg的目的蛋白,且该人CD4胞外区蛋白具有良好的抗原性。小鼠血清监测结果显示人CD4蛋白能有效刺激机体产生免疫应答,显示其具有良好的免疫原性。结论:本研究通过杆状病毒-昆虫细胞系统进行高效表达,获得抗原性和免疫原性良好的人CD4胞外区蛋白,为HIV受体和感染的研究奠定基础。

神经营养素-4(NT-4)在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势，表达出具有生物学活性的神经营养素-4（ hNT-4）蛋白。方法 通过 PCR方法获得 hNT-4成熟肽的基因，将其连接到昆虫表达载体 pAcGP67B上，在昆虫细胞 Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得 hNT-4蛋白的表达产物， SDS-PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为 15 000。 经 Western-blot验证，表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人 NT-4抗体发生特异性免疫反应的条带。经 PC12细胞测定，表达上清中的 rNT-4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT-4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究 hNT-4的功能及其在临床中的应用提供了条件。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此,系统了解这些复合体的生物学功能,将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点,因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体,为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。

蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q Exactive)对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。

Tat-Vp3融合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达与纯化及其促凋亡功能的研究

目的:采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获取可溶性His-Tat-Vp3融合蛋白,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建重组质粒pFastBac^(TM)1-TAT-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,获得杆状病毒质粒,转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒,纯化并扩增该病毒。用最适滴度的病毒刺激Sf9细胞以诱导His-Tat-Vp3蛋白表达,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定,获得分子质量约21 kDa的融合蛋白。采用MTT实验与流式细胞技术检测500、1 000、2 000 nmol/L的融合蛋白抑制肿瘤细胞(HeLa细胞)增殖及促凋亡的活性。结果:通过昆虫表达系统成功表达及纯化出Tat-Vp3融合蛋白,其中1 000、2 000 nmol/L融合蛋白组可显著抑制肿瘤细胞的增殖,并提高细胞的凋亡率。结论:成功构建His-TAT-VP3融合蛋白昆虫系统表达载体,在昆虫表达系统中可诱导性可溶性高表达,所获融合蛋白能显著抑制HeLa细胞的增殖,并促进其凋亡。

棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

以棉铃虫(helicoverpa armigera)组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bad、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4 d的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测.结果:感染上清中的芽生病毒的DNA作模板扩增出预期的1 700bp片段,SDS-PAGE、Western-blotting检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性.

非洲猪瘟病毒P30蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪血清中非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA方法,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018株基因组为模板优化合成CP204L基因(1 bp~549 bp),构建pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(rP30),以Ni亲和纯化后的rP30作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立了一种快速检测ASFV P30抗体的血清学方法。结果显示,胞外分泌的rP30约为30 ku,western blot鉴定结果显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为0.4μg/mL,待检血清稀释倍数为1.25,血清反应时间为30 min,兔抗猪IgG-HRP稀释度为1.10000。利用该方法同时检测猪临床常见病毒阳性血清,结果显示建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV感染血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒和猪口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;将ASFV感染血清2倍倍比稀释后,利用本实验建立的ASFV抗体间接ELISA方法、ID.VET(P32)试剂盒和INGENASA(P72)试剂盒同时检测,结果显示本实验建立的方法检测灵敏度为1.128,与INGENANA(P72)试剂盒相同,低于ID.VET(P32)试剂盒(1.1024);批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性良好。利用该方法与ID.VET试剂盒同时对383份临床样品进行检测,二者符合率为98.9%。本研究建立的方法可为ASF的监测和防控提供技术支持。

密码子优化的鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的表达

为了使鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)的E蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统中高效表达,本研究将DTMUV的E基因按照昆虫细胞偏嗜性密码子进行了优化,合成了基因optiE,并将其插入到pFastBac HT载体上,得到质粒pFastBac-optiE。将该质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组转座子rBacmid-optiE。将rBacmid-optiE转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验和Western blot方法都证实目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。本研究为进一步研究DTMUV E蛋白的结构与功能奠定了基础。

经密码子优化的猪Ficolin α在昆虫细胞的表达及其体外抗病毒作用初步分析

利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达具有天然构象的猪Ficolinα。首先构建重组穿梭质粒rBacmid-Ficolinα,转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-Ficolinα;通过Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析确定较佳表达条件;纯化目的蛋白质后,进一步评价其体外抗病毒活性。Western blot结果显示以7.5MOI接种量感染的sf9细胞在96h时获得了较高的表达,同时获得的重组猪Ficolinα具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性。猪Ficolinα在sf9昆虫细胞中获得成功表达,且具有良好的抗PRRSV活性。本研究可以为猪Ficolinα的抗病毒活性及作用机制研究提供物质基础。

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的形成

目的 在昆虫细胞中同时表达HCV的核心蛋白C和包膜蛋白 (E1、E2 )以形成病毒样颗粒 (VLP)。方法 利用PCR技术得到HCV的核心蛋白和包膜蛋白基因 ,用基因重组技术分别构建表达HCVC、E1和E2蛋白的重组杆状病毒 ,用SDS PAGE电泳分析HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达。电镜观察昆虫细胞内VLP的形成。结果 得到了能表达HCVC蛋白和同时表达E1、E2蛋白的重组杆状病毒reBV/C和reBV/E1、E2。reBV/C和reBV/E1、E2共感染的昆虫细胞同时表达了C、E1和E2蛋白 ,分子量分别为 2 0kD ,35kD和 6 6kD。电镜观察到表达HCV结构蛋白的昆虫细胞质中存在大量的直径为 4 0～ 6 0nm的VLP ,对照细胞无此结构。结论 在昆虫细胞中表达的HCVC。

基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的SARS-CoV-2 S1蛋白的高效表达

目的 设计、构建表达新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) S1蛋白的重组杆状病毒,建立并优化其在昆虫细胞中的生产工艺,为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断方法的建立及疫苗开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术将S1基因插入pFastBac^(TM)1质粒,获得重组质粒pFastBac-S1,经转座获得重组杆粒rbacmid-S1,转染Sf9细胞后包装获得重组杆状病毒rBV-S1,通过rBV-S1感染High Five^(TM)(Hi5)细胞表达S1蛋白,使用Western blot分析鉴定S1蛋白的表达。在此基础上,建立优化rBV-S1扩增和蛋白表达的工艺,以实现S1蛋白的高效表达。结果 通过特异性引物PCR扩增重组质粒pFastBac-S1与重组杆粒rbacmid-S1,获得大小分别为2 367 bp、4 370 bp的基因片段,表明S1基因成功克隆入pFastBac^(TM)1质粒与bacmid;采用Western blot分析细胞培养上清液,在78 ku处有特异性反应条带,证明在昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(Insect cell-baculovirus expression vector system, IC-BEVS)中成功表达有反应原性的S1蛋白。Sf9细胞以1.5×10^(6)cells/mL接种,MOI=0.01接毒,96 hpi可收获最大病毒滴度为(8.40±0.16)lgTCID_(50)/mL;Hi5细胞以0.8×10^(6)cells/mL接种后培养36 h,以MOI=1接毒,48 hpi可获得最大S1蛋白产量为(4.33±0.09) mg/L。结论 利用IC-BEVS成功表达了S1蛋白,并建立了优化的S1蛋白生产工艺,实现了S1蛋白的高效表达,对COVID-19临床诊断方法的建立及疫苗开发具有重要意义。

信号肽对SARS-CoV-2 S1、RBD、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响

目的比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响。方法选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组。通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库。将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×10^(6)个/mL)和对数生长中期细胞(1.2×10^(7)个/mL)。将各组病毒培养至100 mL(500 mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测。S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证。结果B2、C4病毒接种至高密度细胞,分泌表达量未提高,接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异。A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高,A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组;C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag)。分别选择每种蛋白表达量较高的2组(A4、A9;B4、B6;C3、C4)进行重复验证确定,结果显示,A4、B6、C4的分泌表达量最高。结论S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同,是GP67信号肽,而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽。表明N-端序列会影响蛋白的分泌,信号肽序列有一定的通用性,但也与要表达的目的蛋白序列有关。

昆虫细胞培养研究进展

随着生命科学的迅速发展,细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值,已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展,包括昆虫细胞培养基研究开发,昆虫细胞系的建立和组织培养,利用生物反应器大规模培养昆虫细胞,昆虫细胞-杆状病毒表达系统(B acu lov irus express ion vector system,BEV S),构建基因工程细胞系及其稳定性表达,以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。

柞蚕核多角体病毒基因工程载体的研究——Ⅰ柞蚕核多角体病毒DNA限制性内切酶图谱

1983年,美国Smith及Summers首次用苜蓿丫纹夜蛾（Autographa ealifornice）核多角。体病毒（Nucleic polyhedrosis Virus NPV）作载体,通过昆虫细胞培养,表达人的β-干扰素取得成功。1985年日本Maeda（前田）等用家蚕核多角体病毒（BmNPV）作载体,在家蚕幼虫体内表达人的α-干扰素、近年来利用昆虫杆状病毒载体成功地生产近20种外源基因产物,包括白细胞间素-2及3,类胰岛素生长因子,乙型肝炎疫苗及艾滋病病毒gP41蛋白疫苗等。最近,我国储瑞银等用BmNPV载体表达了肝炎病毒的表面抗原。

人细胞色素P450 CYP2C19与CYPOR、CYPb5共表达模型的构建及其抑制剂筛选

目的:获得人细胞色素P450 2C19(CYP2C19)蛋白重组酶,用特征性底物表征重组酶活性,并将该重组酶用于天然产物CYP2C19抑制剂的筛选。方法:构建含人CYP2C19基因的重组杆状病毒穿梭质粒,使用昆虫细胞-杆状病毒表达系统共表达人CYP2C19、细胞色素氧化还原酶(CYPOR)和细胞色素b5(CYPb5);用蛋白印迹分析(Western Blot)鉴定重组酶的表达;以奥美拉唑为底物进行代谢孵育,HPLC分析鉴定酶的活性;并使用该重组蛋白对70种天然产物进行抑制能力的筛选。结果:Western Blot结果显示重组人CYP2C19蛋白在Sf 9细胞中成功表达,该重组酶代谢经典底物奥美拉唑的酶动力学参数分别为:米氏常数Km为(4.99±0.22)μmol.L-1,最大反应速率Vmax为(0.2539±0.0024)μmol.min-1.mg-1蛋白,表观清除率CLint值为0.0509 L.min-1.mg-1蛋白。对70种天然产物的抑制筛选实验显示白藜芦醇、大黄素、异土木香内酯、莪术醇、薄荷脑、鬼臼毒素、补骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、新狼毒素B等对人CYP2C19有比较明显的抑制能力。结论:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,可获得代谢活性良好的重组人CYP2C19蛋白,该重组酶可进一步用于其他底物的Ⅰ相代谢研究以及各种抑制剂的筛选。

小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性

为了构建具有天然构象的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒,本试验扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分别克隆至双启动子载体pFastBac^(TM) Dual中,构建含有双目的基因的重组供体质粒pFastBac^(TM) Dual-2M、pFastBac^(TM) Dual-2F和pFastBac^(TM) Dual-2H;测序正确后转化至DH10Bac^(TM) 感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-2M、rBacmid-2F和rBacmid-2H;将其分别转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒rpFB-2M、rpFB-2F和rpFB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38 000,59 000,68 000左右的条带,表明基质膜蛋白与2种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。本试验为后续小反刍兽疫病毒(PPRV)病毒样颗粒疫苗的进一步研发奠定了基础。