ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。

意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

利用BactoBac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA2,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA2基因的重组病毒rBacmid-AmPLA2的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA2。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞,在细胞中表达AmPLA2。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×HisTag融合表达的产物蛋白分子量约为18kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5·35%。Westernblot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA2抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6·13μmol·min-1·mg-1。

EBV-LMP1基因杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的 构建EBV LMP1基因的杆状病毒重组供体质粒 ,包装重组LMP1的杆状病毒 ,感染昆虫细胞进行表达。方法 先将已克隆的LMP1cDNA与线性化的pFASTBACHTb进行连接 ,使pFASTBACHTb LMP1与DH1 0BAC感受菌进行转座重组 ,利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid/LMP1克隆 ,提取Bacmid/LMP1转染昆虫细胞Sf9包装杆状病毒 ,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达 ,通过免疫荧光、SDS PAGE和Western blot检测表达情况。结果 获得了重组LMP1的杆状病毒 ,细胞能表达出与LMP1单抗结合的蛋白 ,分子量为 6 3kDa左右 ,细胞可直接分泌LMP1蛋白至上清。结论 LMP1能在昆虫细胞中获得良好表达 。

在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M_2及M_5受体重组突变体

目的为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台。方法用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记。将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白。Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能。结果通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体。将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变。Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力。结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究。

重组杆状病毒/昆虫细胞表达体系在肿瘤研究中的应用

杆状病毒/昆虫细胞表达体系是一套新的真核表达体系,本文介绍了该体系的技术原理,以及利用该体系表达癌基因蛋白产物、肿瘤病毒抗原的应用情况,为肿瘤的基础和临床研究提供有用的分子生物学新技术。

人MC1R基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MC1R为模板,利用PCR方法扩增人MC1R基因,将MC1R基因连接到pfastBac1质粒上,与穿梭载体DH10Bac转座,获得Bacmid-MC1R质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE检测表达产物,放射受体分析法检测目的蛋白MC1R活性。结果Bacmid-MC1R质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱,在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和,具有生物学活性。结论MC1R基因成功在真核细胞中得到表达。

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ９ 。方法：采用ＲＴＰＣＲ技术，自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ９ 全编码区ｃＤＮＡ，将其克隆入ｐＣＲＴＭ Ⅱ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ１ 真核表达质粒，经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ９ ｃＤＮＡ 定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ 质粒，进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ 中，在昆虫细胞Ｓｆ９ 中进行表达，采用ＳＤＳＰＡＧＥ对表达产物进行分析。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出人ＦＧＦ９ 重组蛋白。结论：人ＦＧＦ９ 在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中得到了表达。

犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定

为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H,并将表达的重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应;以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,可见相对分子质量为63和68ku左右的条带,分别为重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH),大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达,且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。

重组杆状病毒/昆虫细胞表达体系及其在免疫学中的应用

本文对杆状病毒／昆虫细胞表达体系作一概述，包括杆状病毒的生物学性状、杆状病毒转染载体、共转染的杆状病毒DNA以及该体系的优化表达和在免疫学中的应用情况等。

人CD4胞外区蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达纯化及性质鉴定

目的:通过条件优化实现人CD4蛋白胞外区在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的高效表达,并对纯化获得的人CD4蛋白胞外区进行抗原性与免疫原性分析。方法:通过选择人CD4分子胞外片段构建重组杆状病毒(p Ac-CD4),然后感染昆虫细胞进行蛋白的表达,采用镍离子亲和层析纯化。运用SDS-PAGE、Western blot、体积排阻色谱、ELISA、SPR法等分析纯化得到目的蛋白的理化性质和抗原性。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB/c小鼠,监测小鼠免疫血清的抗体生成。结果:经纯化可获得纯度90%以上的人CD4蛋白,每升细胞培养液最终可获得11.2 mg的目的蛋白,且该人CD4胞外区蛋白具有良好的抗原性。小鼠血清监测结果显示人CD4蛋白能有效刺激机体产生免疫应答,显示其具有良好的免疫原性。结论:本研究通过杆状病毒-昆虫细胞系统进行高效表达,获得抗原性和免疫原性良好的人CD4胞外区蛋白,为HIV受体和感染的研究奠定基础。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此,系统了解这些复合体的生物学功能,将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点,因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体,为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。

猪传染性胃肠炎病毒S基因杆状病毒/昆虫细胞表达系统重组质粒的构建

用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC—S。用DH10BAC对BAC—S进行转位,获得重组质粒pBAC—S。根据S基因酶切位点分析结果及杆状病毒(Bac-ulovirus)转位区结构特点,用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定,并用特异性和通用引物进行PCR分析,证明该重组质粒为含有TH-98株完整S基因的可直接在昆虫细胞进行表达的感染性重组质粒。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。

蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q Exactive)对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。

HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒(P4),通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠(gD2组),以PBS作为阴性对照(PBS组),ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果:PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×109 pfu·mL-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37 000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。

神经营养素-4(NT-4)在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势，表达出具有生物学活性的神经营养素-4（ hNT-4）蛋白。方法 通过 PCR方法获得 hNT-4成熟肽的基因，将其连接到昆虫表达载体 pAcGP67B上，在昆虫细胞 Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得 hNT-4蛋白的表达产物， SDS-PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为 15 000。 经 Western-blot验证，表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人 NT-4抗体发生特异性免疫反应的条带。经 PC12细胞测定，表达上清中的 rNT-4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT-4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究 hNT-4的功能及其在临床中的应用提供了条件。

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒系统中的表达

将编码鸡的白细胞介素 1 8(chickeninterleukine 1 8,ChIL 1 8)成熟蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上 ,构建真核转移载体pMelBacBChIL 1 8,经限制性内切酶消化、ChIL 1 8特异引物PCR鉴定和确证性序列测定 ,证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacBChIL 1 8质粒与杆状病毒DNA(Bac N BlueTM DNA)共转染sf9昆虫细胞 ,经四轮蓝斑筛选纯化 ,获得了重组杆状病毒 ,命名为rBaculovirusChIL 1 8。提取病毒染色体DNA ,经ChIL 1 8特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定 ,证明获得了纯化的重组杆状病毒。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞 ,收获接种后不同时间的细胞进行SDS PAGE电泳。结果表明ChIL 1 8基因在昆虫细胞中获得了表达 ,表达的重组蛋白分子量约为 2 3kDa。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIL 1 8多克隆抗体进行Westernblot分析 ,表明本研究真核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白和前期原核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白均具有生物学活性。

利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。