杆状病毒DNA聚合酶基因的研究概况

杆状病毒DNA聚合酶基因属于杆状病毒早期基因,是杆状病毒复制的必需基因。它编码病毒诱导的DNA聚合酶,能与其它复制因子一起与杆状病毒DNA的同源区和非同源区的顺式作用元件相互作用起始DNA复制。此基因作为杆状病毒系统发育分类的依据,较之包涵体蛋白、egt基因有更大的优势。

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。

对虾白斑杆状病毒DNA聚合酶调控序列的克隆

为了揭示对虾白斑杆状病毒的致病机理,将该病毒基因组中推测的DNA聚合酶上游调控序列克隆进荧光素酶报告基因载体中,以便寻找一个能表达该病毒基因的细胞系统。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

血清中DNA聚合酶α在阿尔茨海默病中的表达和诊断价值分析

目的探究血清中DNA聚合酶α(DNA polα)在阿尔茨海默病(AD)中的表达水平,分析其在AD中的诊断价值。方法选取2019年3月至2023年4月在首都医科大学宣武医院就诊的AD痴呆(DAT)期患者100例作为DAT组,轻度认知障碍(MCI)期患者43例作为MCI组;同期,选取68例同年龄组别的健康者作为HC组。检测各组血清样本中DNA polα的表达水平,利用受试者工作特征(ROC)曲线分析DNA polα在AD中的诊断价值。结果DAT组血清DNA polα表达水平高于MCI组(P<0.05)和HC组(P<0.001),随着AD病程发展,DNA polα表达水平有递增趋势。DNA polα表达水平与简易智能精神状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分均呈负相关(r=-0.1553、-0.2037,P<0.05)。DNA polα诊断DAT期的曲线下面积(AUC)为0.682,灵敏度为0.900,特异度为0.412;DNA polα诊断MCI期的AUC为0.546,灵敏度为0.977,特异度为0.250;DNA polα鉴别诊断MCI期和DAT期的AUC为0.664,灵敏度为0.780,特异度为0.535。结论DNA polα在DAT期AD患者中表达水平升高,且其表达水平与AD病程发展存在一定联系,推测DNA polα有可能是诊断AD潜在的血液生物标志物。

杆状病毒的DNA聚合酶

杆状病毒是一类大分子的双链DNA病毒,目前被广泛地应用于生物农药、蛋白质表达和疫苗生产。DNA复制是杆状病毒生命周期中最重要的事件,其中DNA聚合酶在病毒复制过程中起着关键的作用。本文介绍了杆状病毒DNA聚合酶的结构与功能,以及DNA聚合酶参与病毒复制和装配机理的研究进展。

DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

DNA聚合酶η小分子抑制剂筛选

DNA损伤修复以及基因组稳定性维持对于动植物正常生长和防御逆境至关重要。针对DNA聚合酶错误掺入导致的基因组不稳定性,本研究以DNA聚合酶η为研究对象,通过计算分子模拟对接的方式,对其可能的小分子抑制剂进行筛选,并对其酶动力学参数进行测定。结果显示:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate,d ATP)对DNA聚合酶η的活性具有抑制效果,使其延伸的相对效率为36%~42%。分子模拟对接和体外实验结果表明,相较于dATP(亲和力为-26.7 kJ/mol),环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)与DNA聚合酶η具有更低的结合能(亲和力为-35.1 kJ/mol)。酶动力学参数测定结果也表明,相较于dATP,cGAMP具有更强的抑制能力且在浓度为0.5 mmol/L时达到最强(相对延伸效率为13%)。因此,本研究筛选获得了针对DNA聚合酶η的一种潜在的小分子抑制剂。同时,鉴于该蛋白质高表达导致细胞对抗肿瘤药物(DNA损伤剂)的耐受性,这为新型药物的开发提供了依据。

DNA聚合酶θ的合成致死作用研究

利用合成致死(SL)作用治疗癌症可能会成为一种有效且对患者安全的方案。在诱导合成致死效应的众多因素中,参与DNA修复的因素是最密切相关的。当一个经典的DNA双链断裂(DSB)修复途径发生突变时,替代途径可能是消除肿瘤细胞的靶标。目前,抑制缺乏经典修复途径肿瘤细胞中的RAD52和/或PARP1一直是诱导合成致死作用的潜在靶标,但是,常用的PARP1抑制剂(PARPi)的耐药性是制定治疗方案的最大障碍。由POLQ基因编码的DNA聚合酶θ(Polθ)介导的末端连接(TMEJ)在另一种DSB修复途径起关键作用。因此,它是治疗具有同源重组修复(HRR)缺陷肿瘤的潜在靶点,抑制其活性可以诱导SL。在本综述中,主要讨论了基于靶点Polθ合成致死性的抗癌疗法的现状。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

Pfu-sso7d DNA聚合酶的制备及反应缓冲液的研究

目的:制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法:运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d,采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达,将菌液超声破碎并提取上清液,应用镍亲和层析洗脱纯化取得较纯Pfu-sso7d DNA聚合酶。采用qPCR方法对酶进行酶活力单位定量、确定反应缓冲液组分最佳浓度及检测自制Pfu-sso7d DNA聚合酶酶活性。结果:在1 mmol·L^(-1) IPTG、16℃条件下诱导Pfu-sso7d DNA聚合酶菌液16 h,Pfu-sso7d DNA聚合酶高效表达;用20~100 mmol·L^(-1)咪唑可将蛋白洗脱。Pfu-sso7d DNA聚合酶最终活力单位定量为1 U·μL^(-1)。PCR最佳反应缓冲液为pH9.0、20 mmol·L^(-1) Tris-HCl、0.6 mmol·L^(-1) MgSO_(4)、50 mmol·L^(-1) KCl、5 mmol·L^(-1)(NH_(4))_(2)SO_(4)、0.1%Triton X-100,添加剂组分为3%DMSO、1 mol·L^(-1)甜菜碱。Pfu-sso7d DNA聚合酶能高效扩增3000 bp的目的条带,活性达到商用高保真DNA聚合酶水平。结论:基于基因重组制备的Pfu-sso7d DNA聚合酶可进行高效的PCR反应,节省了实验室PCR成本,为进一步提高Pfu DNA聚合酶活性提供一定技术参考。

杆状病毒介导的靶向DNA甲基转移酶1 siRNA表达载体的构建

目的:构建携带DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)RNAi基因的重组杆状病毒载体,以进一步研究DNMT1对胰腺癌相关基因的影响。方法:首先将带有BglⅡ和HindⅢ酶切黏性末端的60 bp正义和反义寡核苷酸退火,与用BglⅡ和HindⅢ双酶切后的线性化载体pSUPER连接构建成pSUPER si-DNMT1-D,然后将H1启动子和RNAi序列从上述重组载体切下,插入至同样双酶切的pFastBac1载体,经过转座重组,抽提重组BacmidDNA,转染草地贪夜蛾细胞Sf9,获得重组杆状病毒Bac-si-DNMT1-D。将上述重组杆状病毒感染胰腺癌PaTu8988细胞系,其中以重组杆状病毒r-Bac-CMV-EGFP作为阴性对照。然后运用荧光定量PCR检测DNMT1基因表达变化。结果:重组杆状病毒能够感染PaTu8988细胞,并且能显著干扰DNMT1基因表达。结论:杆状病毒表达系统可以作为RNAi载体,为以后的基因治疗开辟新的途径。

用聚合酶链反应(PCR)检测对虾杆状病毒

用聚合酶苗反应（PCR），对36份养殖中国对虾，13份海水、虾池底泥、饵料生物及其它养殖环境中的甲壳动物进行了杆状病毒检测，共检出带毒虾23份，带毒海水1份。电子显微镜技术证实了检测的可靠性。

基于BmNPV DNA聚合酶基因对昆虫杆状病毒系统进化的分析

将家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶基因与2009年3月前完成全基因组测序的49种杆状病毒DNA聚合酶基因进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,并建立基于氨基酸序列的系统进化树。结果显示,该系统进化树支持将杆状病毒分为鳞翅目核型多角体病毒、鳞翅目颗粒体病毒、膜翅目杆状病毒和双翅目杆状病毒的最新建议分类系统,且BmNPV与其他大多数核型多角体病毒同源性较高,属于鳞翅目Group I NPVs,与AcMNPV、PlxyNPV亲缘关系最近。

实时荧光聚合酶链式反应检验用于乙型肝炎病毒DNA检测的价值分析

目的:探讨实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检验用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测中的价值。方法:选取2020年1月—2023年1月清镇市第一人民医院收治的乙型肝炎患者112例为研究对象,均经标准abbot药盒检测确诊,包括HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAg(+)(临床习惯称为“大三阳”)62例、HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAb(+)(临床习惯称为“小三阳”)50例。患者均接受酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验HBV-DNA。将标准abbot药盒检测结果作为金标准,评价酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验的诊断效能。结果:临床最终诊断结果显示“大三阳”62例(阳性)、“小三阳”50例(阴性),酶联免疫吸附法检出阳性50例、阴性62例,实时荧光PCR检验检出阳性58例、阴性54例;实时荧光PCR检验诊断准确度、特异度、灵敏度高于酶联免疫吸附法检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:与酶联免疫吸附法检验比较,HBV-DNA检测中采取实时荧光PCR检验,可提高对“大三阳”与“小三阳”的诊断效能。

杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1 siRNA对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的:观察杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1(DNA-methyltransferase 1,DNMT1)siRNA(小干扰RNA)对人胰腺癌PaTu8988细胞凋亡的影响。方法:人胰腺癌细胞PaTu8988用6孔板培养并随机分成5组:空白组、阴性组、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)、r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组)。空白组仅加10%胎牛血清和DMEM培养基培养,阴性组、D1组、D2组、D3组加血清和DMEM培养基培养24 h后,分别加入空白载体r-Bac-CMV-EGFP和重组杆状病毒r-Bac-si-DNMT1-D1、r-Bac-si-DNMT1-D2、r-Bac-si-DNMT1-D3,150μL/孔。72 h后收集5组细胞,用流式细胞术测肿瘤细胞凋亡,蛋白质印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达情况。结果:D1组、D2组和D3组的细胞凋亡率明显高于空白组和阴性组(P<0.05)。与空白组和阴性组相比,D1组、D2组和D3组Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论:杆状病毒介导的DNMT1siRNA通过抑制Bcl-2蛋白表达,增加Bax蛋白表达,诱导胰腺癌细胞的凋亡。

聚ADP-核糖聚合酶-1在喉鳞状细胞癌细胞DNA氧化损伤及凋亡中的作用

目的探究聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP1)在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达及其对LSCC细胞DNA氧化损伤与凋亡的影响。方法收集40例患者的LSCC组织及癌旁组织样本,采用免疫组化染色和qRT-PCR检测LSCC组织与癌旁组织中PARP1的表达。采用不同浓度Menadione诱导LSCC细胞系Hep-2,MTT法检测不同浓度诱导下细胞增殖抑制率。将Hep-2细胞随机分为对照组(正常培养)、Men组(20μmol/L Menadione处理)、Men+PARP1抑制剂组(20μmol/L Menadione+10μmol/L PARP1抑制剂Olaparib共处理)。MTT法计算各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;细胞免疫荧光染色观察各组细胞DNA损伤标记分子γ-H2AX焦点生成情况;Western blot测定各组细胞γ-H2AX、DNA-PKcs、BRCA1、LIG4、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达;Hoechst33258染色观察各组细胞凋亡情况。结果LSCC组织中PARP1阳性表达率及PARP1 mRNA表达均明显高于癌旁组织(P<0.01)。Hep-2细胞经不同浓度Menadione诱导后,细胞增殖抑制率均升高(P<0.05)。与对照组比较,Men组和Men+PARP1抑制剂组的细胞增殖抑制率升高,细胞ROS水平升高,γ-H2AX焦点形成明显增加,γ-H2AX蛋白表达上调,DNA-PKcs、BRCA1、LIG4蛋白表达均下调,细胞出现浓缩、碎裂的蓝色凋亡体,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05),且Men+PARP1抑制剂组以上变化较Men组更明显(P<0.05)。结论PARP1在LSCC组织中高表达,抑制其表达能够进一步加重Menadione诱导的Hep-2细胞DNA氧化损伤,并促进细胞凋亡。

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生TaqDNA聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为:IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值,最佳发酵工艺参数为:发酵温度37.2℃,pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA聚合酶比活力达到(43.822±0.878)kU/mg。

家蚕核多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆

从家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）基因组中克隆了完整的ＢｍＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因。详细的限制性内切酶酶谱分析表明：ＢｍＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因的限制性内切酶图谱与苜蓿尺蠖核多角体病毒（ＡｃＭ－ＮＰＶ）ＤＮＡ的聚合酶基因图谱完全一致，且在基因组中的位置亦相似。ＤＮＡ聚合酶基因的部分测序结果显示：ＢｍＮＰＶ与ＡｃＭＮＰＶ的ＤＮＡ聚合酶有高度的同源性，远高于ＡｃＭＮＰＶ和舞毒蛾核多角体病毒（ＬｄＭＮＰＶ）两者的ＤＮＡ聚合酶间的同源性，说明ＡｃＭＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ间的亲缘关系比ＬｄＭＮＰＶ要近，从分子进化的角度来看，用表型性状进行杆状病毒科属以下的分类似乎并不适宜。

EB病毒DNA聚合酶基因的表达与纯化及其在鼻咽癌病人诊断中的应用

以Epstein -Barr病毒 (EBV)DNA聚合酶为抗原 ,建立了简便、快速、敏感和特异的鼻咽癌诊断方法。构建原核表达载体 pRSET -DNA聚合酶及其亚克隆 pRSET -A1和 pRSET -A2 ,在BL2 1 (DE3 )中表达的产物 ,经Western -blot检测其抗原性并用于检测鼻咽癌 (nasopharyngealcarcinoma,NPC)病人血清中的抗体。在NPC病人血清中存在抗EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体 ,并证明DNA聚合酶的抗原性主要集中于后 2 / 3片段 (A2 )上。Western -bolt检测A2 /IgG抗体的敏感性和特异性分别为 80 %和 1 0 0 %。对 4 6份NPC病人血清和 4 6份非NPC头颈癌症病人血清 ,用ELISA检测A2 /IgA ,敏感度为 89% ,特异度为 93 %。初步建立了ELISA检测NPC病人血清中A2 /IgG抗体的方法 ,获得较高的敏感性和特异性。